丹红注射液激活AMPK保护心肌缺血再灌注损伤模型大鼠的实验研究*

田 心 王渊博

（1.陕西省中医医院，陕西 西安 710003；2.沈阳军区总医院，辽宁 沈阳 110015；3.第四军医大学，陕西 西安 710032）

腺苷酸活化的蛋白激酶（AMPK）是调节细胞能量代谢的重要分子［1］，当细胞处于应激状态时，胞内的AMP不断堆积，由此激活AMPK。AMPK通过增加在胞内的葡萄糖转运以及糖酵解，维持ATP浓度，而使细胞生存。丹红注射液在临床治疗缺血性心脏病多年，疗效良好。本实验旨在阐明丹红注射液保护心肌的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SD雄性大鼠由第四军医大学实验动物中心提供。36只，体质量200～250 g，SPF级饲养条件，标准饲料喂养，动物合格证号：SCXK（军）字第2007-007号。

1.2 试药与仪器

丹红注射液购自陕西步长制药有限公司 （国药准字：Z20026866，规格：10mL/支，批号：15041024）。兔抗p-AMPKα、AMPKα抗体购自美国abcam公司；肌钙蛋白 T（TnT）、乳酸脱氢酶（LDH）的 ELISA 试剂盒购自AMEKO公司；酶标仪为美国Molecular Devises公司产品；倒置显微镜为日本Nikon公司产品；透射电镜为日本JEOL公司产品；电泳系统及凝胶成像系统均为Bio Rad公司产品。

1.3 造模方法

用3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠（1.5mL/kg），气管插管，微型动物呼吸机给予正压机械通气，常规肢体Ⅱ导联心电图记录心电活动，分离左侧颈静脉，经左侧颈静脉插管，建立给药途径；于大鼠胸骨左缘第4～5肋间开胸，暴露心脏，撕开心包膜，在左心耳下缘处穿线（6/0丝线），以备结扎冠状动脉左前降支（LAD），用直径约0.2 cm细塑料管穿过结扎线，以心电图ST段明显抬高、缺血数分钟后出现明显的心律失常作为心肌缺血标志。缺血30min，再灌注2 h。

1.4 分组与给药［2］

将36只实验大鼠随机分为对照组、对照加丹红组、缺血/再灌注组、缺血/再灌注加丹红组。每组9只。为保证实验质量，借鉴于文献［2］研究发现的药效时间点，最大药效时间点为10 min，最小药效时间点为60 min，按8 mL/kg于再灌注即刻到结束进行全程颈静脉给药；对照组及缺血/再灌注组给予等体积的无菌生理盐水。

1.5 标本采集与检测

1.5.1 ELISA检测血清中TnT、LDH水平 12只大鼠心尖部穿刺取血，室温放置1 h后，3000 r/min离心15 min，取上清液于-80℃冰箱冻存。按试剂盒要求操作，用酶标仪测定各组样品的吸光度（450 nm）值（OD值），用标准品做标准曲线，并算出方程，将各组OD值代入进行计算出待测样品的浓度值（至少重复3次）。

1.5.2 苏木素碱性复红苦味酸染色（HBFP）［3］之前12只大鼠取血完毕后，分别摘取心脏组织，于4%多聚甲醛中固定24 h，常规石蜡包埋切片。将组织切片常规脱蜡至水，明矾苏木素浸染15 s，常规自来水冲洗5 min，后用0.1%碱性复红液浸染3 mins，用蒸馏水轻轻冲洗10 s，然后用纯丙酮浸泡8 mins，之后用0.1%苦味酸丙酮液分化20 s，至切片上无红色洗脱为止；最后以二甲苯透明后用中性树胶封片，光学显微镜下观察。

1.5.3 透射电镜观察心肌线粒体形态 另12只大鼠实验完毕后，心肌缺血再灌注后，将心脏切出，放置于呈有PBS溶液的容器内，挤压出残留于心腔内的血液。沿心脏长轴的左心组织结扎血管以下区域，剪裁下约2mm×3mm长条形的2块心肌组织，放置2.5%的戊二醛中固定2 h，PBS漂洗3次，每次10min，1%锇酸固定2 h，又以PBS漂洗，之后梯度乙醇脱水处理、浸透，再经过环氧树脂的包埋处理。光镜定位后超薄切片机切割其为厚度20 nm心肌组织切片，经铀铅等染色后，置于透射电镜下，观察心肌内线粒排列分布、线粒体大小改变、线粒体膜及线粒体嵴的结构变化情况。

1.5.4 蛋白免疫印迹（Western blot）检测心肌组织中p-AMPKα/AMPKα的表达 余12只大鼠实验完毕后摘取心脏，切取结扎线周围心脏组织，用组织裂解液加蛋白磷酸酶抑制剂提取各组心肌组织蛋白，并进行蛋白定量，用SDS-PAGE进行电泳，并将其转膜到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上，100 g/L的脱脂牛奶室温封闭1 h后，滴加1∶800的抗p-AMPKα、AMPKα一抗孵育过夜，PBST 洗膜（5 min，5 次），再用 1∶5000 特异性二抗室温孵育1 h后洗膜（5min，5次），进入发光仪器后滴加显影液曝光后观察结果，并利用Quantity One软件对目的条带分析获取数据。

1.6 统计学处理

应用SPSS17.0统计软件。计量资料以（±s）表示，多组间两两比较采用组间t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠心肌缺血再灌注的血清TnT、LDH水平比较

见表1。心肌缺血再灌注时，TnT、LDH明显升高（P＜0.01），使用丹红注射液后，TnT、LDH明显降低（P＜0.01），丹红注射液可明显减轻心肌缺血再灌注的TnT、LDH 水平。

表1 各组大鼠心肌缺血再灌注的血清TnT、LDH水平比较（±s）

表1 各组大鼠心肌缺血再灌注的血清TnT、LDH水平比较（±s）

与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与缺血再灌注组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。 下同。

组 别 n TnT（μg/L） LDH（ng/mL）对照组 3 13.44±2.48 27.96±2.45对照加丹红组 3 12.82±2.88 28.03±1.93缺血再灌注组 3 37.83±5.94** 71.53±8.32**缺血再灌注加丹红组 3 18.22±4.03△△ 33.49±3.40△△

2.2 各组大鼠心肌缺血再灌注心肌组织坏死情况比较

见图1。对心肌组织的特殊染色分析可见：对照组和对照加丹红组的心肌组织，用HBFP法染色可见心肌细胞呈黄色或黄棕色，细胞核呈蓝褐色；缺血再灌注组的心肌组织中可见大片深红色改变，而缺血再灌注加丹红组心肌组织中可见深红色改变明显减轻，区域局限缩小。由此可见，丹红注射液可以减少心肌缺血再灌注的坏死。

2.3 各组大鼠缺血再灌注心肌细胞线粒体损伤情况比较

见图2。大鼠缺血区域心肌组织的透射电镜图片显示：对照组和对照加丹红组的心肌细胞线粒体排列整齐，呈融合状；缺血再灌注组的心肌细胞线粒体呈肿胀改变，部分线粒体分裂明显，呈空泡状改变；缺血再灌注加丹红组的心肌细胞线粒体其病态改变减轻，线粒体排列较整齐。由此可见，丹红注射液可减轻缺血再灌注心肌细胞线粒体损伤。

图1 大鼠的心肌组织切片（HBFP染色，100倍）

图2 大鼠心肌细胞线粒体的透射电镜成像（10000倍）

2.4 各组大鼠缺血/再灌注心肌AMPK的磷酸化水平比较 如图3，表2。结果示，正常大鼠心肌中，加用丹红注射液 的p-AMPKα/AMPKα 水平升高 （P＜0.05）；缺血再灌注时，AMPK激活，p-AMPKα/AMPKα水平升高（P＜0.01）；缺血再灌注时，给予丹红注射液治疗，AMPK进一步激活，较单纯缺血再灌注p-AMPKα/AMPKα水平升高（P＜0.05）；说明丹红注射液可以上调缺血再灌注心肌AMPK磷酸化水平。

图3 丹红注射液对心肌p-AMPKα/AMPKα表达的Western Blot图

表2 各组心肌细胞p-AMPKα/AMPKα表达比较（±s）

表2 各组心肌细胞p-AMPKα/AMPKα表达比较（±s）

组 别 n 灰度比（p-AMPKα/AMPKα）对照组 3 0.51±0.11对照加丹红组 3 0.92±0.20*缺血再灌注组 3 1.31±0.18**缺血再灌注加丹红组 3 2.32±0.57**△

3 讨 论

基于缺血性心脏病的病理生理中，缺血缺氧为其最基本的病变，由此而引发心肌氧供与需求的失衡，AMPK经典的激活机制定义为细胞能量状态受AMP/ATP和ADP/ATP的比值影响［4］。在再灌注中，也就是当氧供再补充时，AMPK诱导的糖酵解有害地影响自由脂肪酸代谢，从而在再灌注过程中阻碍了心脏丰富的ATP产生能力［5］。然而，AMPK激活的纯粹作用是有益的，Kim等［6］证实在LAD闭塞小鼠中，用药物激活AMPK时，梗死面积减小，心脏机能得到更好的保护，同时也发现凋亡和坏死减轻。线粒体为细胞能量代谢供氧、ATP，其结构和功能改变对心血管生理和病理起着关键作用［7］。采用有效药物干预保护心肌细胞线粒体是近年来心血管领域研究的热点。

丹红注射液是临床上使用最多的活血化瘀类中药注射剂之一［8-9］。丹红注射液目前已明确的有效物质为丹参素、原儿茶醛、羟基红花黄色素A、迷迭香酸、丹酚酸B等7种物质［2］。其主要成分与血浆蛋白结合率均＞60%，其组分间的相互竞争影响较小［10］。早期研究发现［11-12］，丹红注射液主要成分改善氧化应激所致的线粒体损伤，防止线粒体质子ATP酶水解，显示良好的保护作用；同时丹红注射液有减轻缺血再灌注心肌血管内皮炎症，促进血管内皮细胞增殖、改善血管内皮功能紊乱的作用［13］。 已有报道［14］丹红注射液能够减轻缺血再灌心肌细胞凋亡，且与浓度有一定的依赖关系。丹红注射液其有效应用在神经系统疾病亦有报道，丹红注射液具有保护脑出血大鼠神经系统功能和减轻脑水肿的作用［15］，且丹红注射液对大鼠脑缺血/再灌注损伤的治疗时间窗应在4 h内，机制与抗氧化有关［16］。但丹红注射液对AMPK的激活作用却尚未报道，因此本研究应用较特殊的HBFP病理染色和心肌酶学指标，以及基础的免疫印迹法和电镜技术阐述了丹红注射液减轻缺血再灌注心肌及线粒体损伤是通过激活AMPK来实现的。

综上所述，丹红注射液能够激活缺血再灌注心肌AMPK信号通路，发挥能量调控作用，保护心肌损伤及线粒体损伤，本基础研究局限于丹红注射液激活AMPK信号通路，我们下一步将阐述其对AMPK信号下游分子的影响及具体保护机制。

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