黄芪多糖通过p38MAPK-HSP27通路减轻大鼠急性坏死性胰腺炎肺损伤*

杨桂菊 张东霞

（1.山东省济宁市中医院，山东 济宁 272000；2.山东省济宁市第二人民医院，山东 济宁272000）

急性坏死性胰腺炎是由多种病因导致的胰腺组织水肿、出血以及胰腺组织的自身消化［1-2］，在发病早期会引发全身性的炎症反应及多个器官功能障碍，肺损伤是临床常见的并发症之一［3］。研究表明，由急性坏死性胰腺炎引发的肺损伤约占肺损伤总数的15%～55%，而且肺损伤也是造成早期急性坏死性胰腺炎患者死亡的主要原因［4］，因此，急性坏死性胰腺炎的早期预防和治疗已经成为医学工作者研究的热点问题。目前临床上治疗急性坏死性胰腺炎的主要手段有抗生素治疗和手术治疗，前者主要集中在对抗炎症方面，不能有效地根除病因，且长期服用抗生素会增加机体的耐药性，手术治疗的费用较高，且不能一次性有效切除坏死胰腺组织，术后还需要进行多次的药物腹腔灌洗，因此探寻高效、安全、低毒的药物是临床治疗急性坏死性胰腺炎的关键环节。本研究以急性坏死性胰腺炎大鼠模型为研究对象，观察黄芪多糖对大鼠急性坏死性胰腺炎肺损伤的影响，并探讨其潜在的分子机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康Wistar雄性大鼠65只，清洁级，6～8 周龄，体质量（120±20）g，购自中国农业大学，许可证号：SYXK（京）2015-0043。实验前将大鼠移置实验室，自然光照室温22～23℃，湿度40%～65%，噪音≤50 dB，自由饮水，进食。

1.2 试药与仪器 黄芪多糖 （生产批号：120102，纯度＞98%）购自赛诺制药有限公司；RNA提取试剂盒和反转录试剂盒购自天根生化科技有限公司；TaqDNA聚合酶购自NEB公司；羊抗鼠p38MAPK、HSP27、pp38MAPK、p-HSP27多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司；MPO试剂盒购自上海赛默科技生物发展有限公司；3K15超低温离心机购自德国Sigma公司；SW-CJ-2D2G2F2FD双人净化工作台购自苏州苏净；引物序列，由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

1.3 造模及分组 从65只大鼠中随机选取10只，开腹后翻动十二指肠，并触碰胰腺数次但不造成胰腺损伤，缝合腹腔，作为假手术组。其余大鼠按照文献资料［5］禁食12 h，术前称重，按1 mL/100 g腹腔注射4%水合氯醛进行麻醉，用75%酒精消毒，仰卧位固定于平板上，在无菌条件下于腹部正中切口，暴露十二指肠，找到胆胰管十二指肠开口处，用无损伤血管夹夹闭肝总管，用3号针头经十二指肠浆肌层行胆胰管逆行穿刺手术，用无损伤血管夹夹闭肝总管远端，用微量注射器向胆胰管内注射5%牛黄胆酸钠 （此操作要缓慢均匀），注射结束后观察10 min，确认大鼠脾、胃及十二指肠间的胰腺组织出现出血坏死后拔除针头、去除血管夹并缝合腹腔。待动物苏醒后回笼饲养。将造模成功的大鼠随机分成4组，每组10只，包括模型组、黄芪多糖低剂量组、黄芪多糖中剂量组和黄芪多糖高剂量组，黄芪多糖组按低、中、高剂量分别给予200 mg/kg、400mg/kg、600mg/kg黄芪多糖灌胃治疗，持续治疗2周；假手术组及模型组给予等量容积0.9%氯化钠注射液灌胃。

1.4 各组大鼠肺组织含水量测定 治疗结束后，将大鼠进行脱颈椎处死，将大鼠置于75%的酒精中消毒2～3 min，将大鼠腹部和胸部剪毛，于无菌条件下打开大鼠胸腔取出肺组织，用吸水纸吸取其表面血迹和水分，称其湿重后，置于90℃烘箱，直至质量不再变化，称其干质量，计算肺系数。肺系数＝（湿质量-干质量）/干质量。

1.5 各组大鼠肺组织中MPO的活性测定 取100mg分离的肺组织，称重，加入1mL 0.5%溴化十六烷基三甲胺溶液，经超声破碎后，置于超低温离心机离心，12000 r/min离心10 min，收集离心上清液，采用髓过氧化物酶（MPO）试剂盒测定5组大鼠肺组织中MPO的活性。

1.6 HE染色检测肺组织的病理学变化 将肺部组织放入4%多聚甲醛液中固定24 h，然后放入25%甲酸脱钙液脱钙处理，用预冷的PBS溶液洗涤2～3次，分别用70%、80%、90%、95%、100%的乙醇进行梯度脱水，二甲苯透明处理，组织浸蜡包埋，用切片机切出4μm厚切片，然后脱蜡，用 100%、95%、90%、80%、70%的乙醇和蒸馏水逐级复水，用苏木精染色5min，用二甲苯透明处理、中树胶封片。在显微镜下观察5组大鼠肺组织的病理学变化。各组大鼠肺损伤评分情况［6］根据肺出血、组织水肿、小气道损伤、炎性细胞浸润进行肺损伤评分，0级为无以上几种病理学变化；1级为病理变化轻且局限；3级为病理变化中等且局部显著；4级为广泛性病理变化且非常显著。

1.7 Westernblot检测 p38MAPK、p-p38MAPK、HSP27、p-HSP27蛋白表达情况 取肺部组织加入细胞裂解液提取总蛋白，以GAPDH为内参，取20μL蛋白样品进行SDS-PAGE，电泳结束后，半干转膜仪转膜50min，滴加羊抗鼠 p38MAPK、p-p38MAPK、HSP27、p-HSP27多克隆抗体，置于4℃下过夜，滴加二抗37℃放置1 h。加入ECL发光剂进行显影，利用自动凝胶成像系统采集图像。采用Gel-Pro analyzer4软件对SDS-PAGE电泳图目的条带进行扫描，分析p38MAPK、p-p38MAPK、HSP27、p-HSP27的表达水平。

1.8 统计学处理 应用SPSS20.0统计软件。计量资料以（±s）表示，多组采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组肺损伤评分检测肺部变化情况比较 见表1。模型组肺组织中出血、组织水肿、小气道损伤、炎性细胞浸润评分显著高于假手术组（P＜0.05）；黄芪多糖组肺组织中出血、组织水肿、小气道损伤、炎性细胞浸润评分显著低于模型组（P＜0.05）；且随着黄芪多糖剂量增加，肺组织中出血、组织水肿、小气道损伤、炎性细胞浸润评分显著降低（P＜0.05），呈剂量依赖性。

表1 各组大鼠肺组织中出血、组织水肿、小气道损伤、炎性细胞浸润评分比较（分，±s）

表1 各组大鼠肺组织中出血、组织水肿、小气道损伤、炎性细胞浸润评分比较（分，±s）

与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与黄芪多糖低剂量组比较，▲P＜0.05；与黄芪多糖中剂量组比较，$P＜0.05。下同。

组别 n假手术组 10模型组 10黄芪多糖低剂量组 10出血 组织水肿 小气道损伤 炎性细胞浸润0.42±0.04 0.54±0.05 0.63±0.04 0.36±0.03 2.92±0.26* 3.24±0.32* 3.56±0.36* 2.74±0.22*2.46±0.24△ 2.75±0.24△ 2.84±0.25△ 2.24±0.20△黄芪多糖中剂量组 10 1.92±0.18△▲ 2.02±0.21△▲ 2.11±0.23△▲ 1.72±0.16△▲黄芪多糖高剂量组 10 1.12±0.15△▲$1.36±0.16△▲$1.47±0.17△▲$0.96±0.13△▲$

2.2 各组大鼠肺组织含水量测定比较 见表2。模型组肺系数显著高于假手术组（P＜0.05）；黄芪多糖组肺系数显著低于模型组（P＜0.05）；且随着黄芪多糖剂量增加，肺系数显著降低（P＜0.05），呈剂量依赖性。

表2 各组大鼠肺组织肺系数测定比较（±s）

表2 各组大鼠肺组织肺系数测定比较（±s）

组 别 n假手术组 10模型组 10黄芪多糖低剂量组 10肺系数 MPO活性3.24±0.28 1.09±0.12 7.24±0.64* 2.32±0.26*6.16±0.56△ 1.04±0.22△黄芪多糖中剂量组 10 5.08±0.52△▲ 1.68±0.19△▲黄芪多糖高剂量组 10 4.01±0.51△▲$ 1.34±0.15△▲$

2.3 各组大鼠肺组织中MPO活性测定比较 见表2。模型组肺组织中MPO的活性显著高于假手术组 （P＜0.05）；黄芪多糖组肺组织中MPO的活性显著低于模型组（P＜0.05）；且随着黄芪多糖剂量增加，肺组织中MPO的活性显著降低（P＜0.05），呈剂量依赖性。

2.4 各组HE染色检测肺组织病理学变化比较 见图1。HE染色结果显示，模型组大鼠肺泡塌陷、肺泡间隙变大，肺小叶结构遭到破坏，边界模糊不清；假手术组大鼠肺组织未见明显异常，与模型组相比，黄芪多糖组肺泡间隙变小，且随黄芪多糖剂量增加，肺泡间隙逐渐缩小。

图1 各组肺组织病理学变化（HE染色，400倍）

2.5 各组 Western blot检测 p38MAPK、p-p38MAPK、HSP27、p-HSP27蛋白表达情况比较 见表3。各组大鼠肺组织中p38MAPK、HSP27的表达水平相比，差异无统计学意义 （P＞0.05）；模型组肺组织中 pp38MAPK、p-HSP27的表达水平显著高于假手术组（P＜0.05）；黄芪多糖组肺组织中p-p38MAPK、p-HSP27的表达水平显著低于模型组（P＜0.05）；且随黄芪多糖剂量增加，肺组织中p-p38MAPK、p-HSP27的表达水平显著降低（P＜0.05），呈剂量依赖性。

表3 各组大鼠Western blot检测p38MAPK、p-p38MAPK、HSP27、p-HSP27 表达情况比较（±s）

表3 各组大鼠Western blot检测p38MAPK、p-p38MAPK、HSP27、p-HSP27 表达情况比较（±s）

组 别 n假手术组 10模型组 10黄芪多糖低剂量组 10 p38MAPK p-p38MAPK HSP27 p-HSP27 0.83±0.08 0.56±0.05 0.66±0.06 0.52±0.05 0.82±0.07* 1.22±0.16* 0.67±0.07* 1.08±0.14*0.84±0.08△ 1.04±0.12△ 0.68±0.07△ 0.96±0.10△黄芪多糖中剂量组 10 0.85±0.09△▲ 0.86±0.09△▲ 0.68±0.06△▲ 0.82±0.08△▲黄芪多糖高剂量组 10 0.83±0.09△▲$0.72±0.07△▲$0.66±0.07△▲$0.68±0.07△▲$

3 讨 论

急性坏死性胰腺炎 是常见的急腹症，具有发病快、病死率高、并发症多、治疗难度大等特点［7］。引发急性坏死性胰腺炎的主要原因包括两方面：血液循环障碍和体内有害物质的积累，但具体的发病机制尚未完全明确。急性坏死性胰腺炎会引发多种并发症，其中肺损伤是临床常见的并发症之一，主要表现为肺水肿、胸腔积液和呼吸困难，这也是诱发急性坏死性胰腺炎患者死亡的主要原因［8］。急性坏死性胰腺炎的临床症状主要表现为持续性发热、急剧腹痛、粪样呕吐、严重的机体脱水，甚至休克［9］，给患者带来极大痛苦，因此，急性坏死性胰腺炎的治疗是医学工作者研究的热点问题。

西医治疗急性坏死性胰腺炎存在一定的局限性，而中医中药由于其安全、低毒的特点受到医学工作者的广泛关注。中医学认为，急性坏死性胰腺炎属于“腹痛”“胃脘痛”“胁痛”“结胸”“厥脱”等范畴［10］，因此，中医治疗急性坏死性胰腺炎以活血化瘀、理气通络为主［11］。 据《本草纲目》记载，黄芪能够通络补气、补肺健脾［12］。 黄芪多糖（APS）是蒙古黄芪根的提取成分，具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化等多种药理作用。研究表明，APS还具有增强机体免疫、促进荷瘤小鼠T、B淋巴细胞的增殖等作用［13］。王秉均研究表明，APS对大鼠重症急性胰腺炎有保护作用［14］，然而APS对急性坏死性胰腺炎大鼠肺损伤的影响尚未见报道，本研究表明，模型组肺损伤、肺系数、MPO的活性显著高于假手术组；黄芪多糖组肺损伤、肺系数、MPO的活性显著低于模型组；且随黄芪多糖剂量增加，肺损伤、肺系数、MPO的活性显著降低，呈剂量依赖性。肺系数越大说明肺组织水肿严重，MPO的活性与炎症反应密切相关，随MPO的活性升高，中性粒细胞增多，炎症反应加重。以上结果均提示，黄芪多糖能够减轻急性坏死性胰腺炎大鼠肺损伤。

p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）能够参与细胞内重要的信号转导途径，与细胞和生物体的多种生命活动密切相关。p38MAPK介导信号通路在机体的炎症反应中具有重要作用［15］。 Choi研究表明，p38MAPK 的活化可以促进IL-1、IL-6、TNF-α等炎性因子的释放，进而促进机体免疫反应的发生［16］；还有研究表明，p38MAPK在大鼠重症急性胰腺炎大鼠肺损伤的发生发展中具有重要作用［17］；江涛研究表明，抑制p38MAPK信号通路可以减轻重症急性胰腺炎胰腺［18］。在p38MAPK/HSP27通路中，p38MAPK磷酸化后能够调节下游的丝裂原活化蛋白激活热休克蛋白 27 （HSP27）［19］，HSP27 作为一种分子伴侣能够参与各种信号通路，并与通路中的关键分子相互作用，使其维持正常的功能［20］。近年来不少学者研究表明HSP27在急性胰腺炎及其并发症中发挥着重要作用。刘乐伟研究表明，HSP27下调表达可以减轻重症胰腺炎大鼠肺损伤［21］。本研究表明，假手术组未见明显异常；模型组p-p38MAPK、p-HSP27的表达水平显著高于假手术组；黄芪多糖组p-p38MAPK、p-HSP27的表达水平显著低于模型组；且随黄芪多糖剂量增加，p-p38MAPK、p-HSP27的表达水平显著降低，呈剂量依赖性，提示，黄芪多糖能够抑制急性坏死性胰腺炎大鼠肺组织中p38MAPK/HSP27通路。

综上所述，黄芪多糖能减轻急性坏死性胰腺炎大鼠肺损伤，推测这一作用是通过抑制p38MAPKHSP27通路实现的，为临床治疗急性坏死性胰腺炎肺损伤提供一定参考依据。

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