松果菊苷通过调节Nrf2表达减轻H2O2致心肌细胞损伤的实验研究*

杨 芳 吴泽幼 包 思 梁 敬

（南方医科大学南方医院，广东 广州 510515）

缺血/再灌注损伤所致心肌梗死是威胁我国居民生命健康的重大疾病之一，其发生与活性氧增多导致氧化应激损伤等相关［1］。目前，有效降低缺血心肌细胞氧化应激损伤是防治心肌梗死的有效手段之一。NF-E2相关因子2（Nrf2）通路可降低活性氧对心肌细胞毒性，缓解心肌细胞应激性氧化损伤，保护心肌细胞［2］。松果菊苷（ECH）具有抗氧化、诱导细胞分化和抗肿瘤等多种药用活性［3］。研究发现，松果菊苷对血管性痴呆大鼠氧化应激损伤具有保护作用［4］。李欢等发现，松果菊苷可通过降低细胞内活性氧水平、减轻炎症反应，具有保护血管内皮细胞损伤的作用［5］。目前，关于松果菊苷对心肌细胞应激性氧化损伤的保护作用及机制的相关研究比较少。因此，本研究采用H2O2构建心肌细胞氧化应激性损伤模型，观察松果菊苷对H2O2所致心肌细胞毒性的影响及对Nrf2通路的影响，以揭示松果菊苷保护H2O2所致心肌细胞损伤的作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验细胞 大鼠心肌细胞H9c2（2-1），购自中国科学院细胞库。

1.2 试药与仪器 松果菊苷（纯度＞98%），购自上海宝曼生物公司，批号201605；Nrf2抑制剂鸦胆苦醇（纯度≥95%），购自美国Sigma公司，批号20160807；30%H2O2（批号 20150108）、DMEM 培养基（批号 8114031）、FBS（批号1227694），购自美国Sigma公司；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒、LDH检测试剂盒、SOD检测试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）、细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒，购自碧云天公司；ELC发光试剂盒、96孔板，购自Bio-Rad公司；BCA试剂盒，购自美国Thermo公司；抗体，购自美国CST公司。Elx800酶标仪，购自美国Biotek公司；荧光显微镜，购自美国Olympus公司；CO2培养箱，购自美国Thermo公司。

1.3 实验方法 细胞培养及处理：采用DMEM培养基（含15%FBS）培养H9c2细胞，每2日传代1次，培养条件：5%CO2，37℃。无菌操作，收集对数生长期细胞用于实验。1）H2O2半数致死浓度确定：在DMEM培养基中分别加入终浓度为 0、50、100、200、400、600 μmol/L H2O2，孵育4 h，采用MTT法对H9c2细胞存活情况进行鉴定，绘制生长率抑制曲线，计算出H2O2半数致死浓度，作为实验浓度。2）实验分组及处理：将H9c2细胞分为空白对照组、H2O2模型组、松果菊苷低剂量组（5 mg/L）、中剂量组（10 mg/L）、高剂量组（20mg/L）。在松果菊苷处理组细胞培养基中分别加入相应浓度松果菊苷，空白对照组和H2O2模型组加入0.9%0.9%氯化钠注射液，预孵育6 h，收集各组细胞，检测各项指标。1.4 观察指标 1）流式细胞仪检测心肌细胞H9c2凋亡情况：收集经过相应处理的各孔H9c2细胞，加入胰蛋白酶进行消化，按照AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡试剂盒（碧云天）说明书对细胞进行处理，采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，采用BD FACSDiva软件统计凋亡细胞所占百分比。每组处理设置4个重复，实验重复3次。2）流式细胞仪检测吸进细胞H9c2线粒体膜电位（MMP）水平：收集经过相应处理的各孔H9c2细胞，加入胰蛋白酶进行消化，按照线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）说明书处理细胞，采用流式细胞仪进行检测。采用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体膜电位（MMP）水平变化情况。3）试剂盒检测培养基中乳酸脱氢酶（LDH）、心肌激酶（CK）、丙二醛（MDA）含量：按照试剂盒操作说明，对各组细胞培养液及H9c2细胞内LDH、CK和MDA的含量进行测定。LDH释放率/%=培养液中LDH含量/（培养液中LDH含量+细胞内LDH含量）×100%，CK和MDA释放率计算方法同LDH。每组设置4个重复，实验重复3次。4）Western blot检测细胞核、质中Nrf2蛋白表达水平：按照细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒说明书，分别提取各组H9c2细胞质及细胞核总蛋白，采用BCA试剂盒测定总蛋白含量。以GAPDH为内参，采用western blot检测细胞质中Nrf2蛋白水平。以Lamin B为内参，采用Western blot检测细胞核中Nrf2蛋白水平。采用Tanon全自动图像分析系统进行拍照并对细胞核、细胞质Nrf2蛋白相对表达水平进行半定量分析。5）采用流式细胞术检测Nrf2抑制剂预处理后心肌细胞凋亡情况和MMP水平：在20mg/L松果菊苷处理H9c2细胞前30min，给予细胞10μmol/L Nrf2抑制剂鸦胆苦醇预处理。按照前文中方法检测心肌细胞H9c2凋亡情况和MMP水平。1.5 统计学处理 应用SPSS22.0统计软件。计量资料以（±s）表示，采用t检验进行差异性分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 H2O2对心肌细胞的毒性 见图1。结果显示，100、200、300、400、500 μmol/L H2O2均能抑制 H9c2 细胞生长，呈现一定的剂量效应。300μmol/LH2O2作用H9c2细胞6h时，对细胞生长抑制率约为50%。因此，本研究选择此浓度处理H9c2细胞以构建H2O2损伤模型。

H2O2μmol/L图1 不同浓度H2O2对H9c2细胞增殖的影响

2.2 各组心肌细胞凋亡情况比较 见图2和表1。与空白对照组比较，H2O2模型组细胞凋亡率明显升高（P＜0.05）；与 H2O2模型组比较，松果菊苷处理组，细胞凋亡率显著降低（P＜0.05）。随着松果菊苷浓度的增加，细胞凋亡率逐渐降低（P＜0.05）。

图2AnnexinV-FITC/PI联合流式细胞仪检测各组H9c2细胞凋亡情况

表1 各组心肌细胞凋亡率（%，±s）

表1 各组心肌细胞凋亡率（%，±s）

与对照组比较，*P＜0.05；与 H2O2模型组比较，◇P＜0.05；与 5mg/L比较，☆P＜0.05；与 10mg/L 比较，△P＜0.05。 下同。

组 别 n对照组 4 H 2 O 2模型组 4 5 m g/L松果菊苷组 4凋亡率7.7±0.4 6 6 5.7±5.6 6*3 6.8±3.4 1*◇1 0 m g/L 松果菊苷组 4 1 7.6±2.0 2*◇☆2 0 m g/L 松果菊苷组 4 1 1.9±0.5 8*◇☆△

2.3 各组心肌细胞线粒体损伤程度比较 见图3和表2。空白对照组比较，H2O2模型组细胞线粒体膜电位显著降低（P＜0.05）；与H2O2模型组比较，松果菊苷处理组细胞MMP均显著升高（P＜0.05），随着松果菊苷浓度的增加，细胞MMP逐渐升高（P＜0.05）。

图3 JC-1联合流式细胞术检测各组H9c2细胞MMP变化情况

表2 各组心肌细胞线粒体损伤程度比较（%，±s）

表2 各组心肌细胞线粒体损伤程度比较（%，±s）

组 别 n对照组 4 H 2 O 2模型组 4 5 m g/L松果菊苷组 4 J C-1 r e d/g r e e n 9 9.7±0.4 6 1 0.7±1.6 6*1 9.8±1.4 1*◇1 0 m g/L 松果菊苷组 4 3 7.6±2.0 5*◇☆2 0 m g/L 松果菊苷组 4 5 1.9±0.6 8*◇☆△

2.4 各组心肌细胞LDH、CK及MDA释放率比较见表3。与空白对照组比较，H2O2模型组的LDH、CK、MDA释放率显著增高（P＜0.05）。与H2O2模型组比较，松果菊苷处理组LDH、CK、MDA释放率均显著降低（P＜0.05）， 随着松果菊苷浓度的增加，LDH、CK、MDA释放率逐渐降低（P＜0.05）。

表3 各组心肌细胞LDH、CK及MDA释放率比较（%，±s）

表3 各组心肌细胞LDH、CK及MDA释放率比较（%，±s）

组别 n M D A对照组 4 9.7±0.8 9 H 2 O 2模型组 4 2 7.7±2.9 6*5 m g/L 松果菊苷组 4 2 0.9±0.8 1*◇L D H C K 1 8.7±1.0 6 1 0.3±0.9 6 6 9.7±2.9 6* 4 2.7±1.9 6*4 8.9±1.8 1*◇ 3 4.9±1.9 4*◇1 0 m g/L 松果菊苷组 4 1 5.6±0.7 5*◇☆3 4.6±1.7 5*◇☆ 2 4.6±2.3 5*◇☆2 0 m g/L 松果菊苷组 4 2 1.3±1.5 8*◇☆△ 1 7.3±2.5 8*◇☆△ 1 1.3±0.8 8*◇☆△

2.5 各组心肌细胞质、细胞核中Nrf2蛋白水平比较见图4和表4。与空白对照组比较，H2O2模型组细胞核中Nrf2蛋白水平明显增加（P＜0.05）；与H2O2模型组比较，松果菊苷处理组细胞核Nrf2蛋白水平进一步增加（P＜0.05），随着松果菊苷浓度的增加，细胞核Nrf2蛋白水平逐渐增加（P＜0.05）。H2O2模型组细胞质Nrf2蛋白水平与空白对照组比较（P＞0.05）；与H2O2模型组比较，松果菊苷处理组细胞质Nrf2蛋白水平显著降低（P＜0.05），随着松果菊苷浓度的增加，细胞质Nrf2蛋白水平逐渐降低（P＜0.05）。

图4 松果菊苷处理对Nrf2蛋白水平的影响

表4 果菊苷处理后各组心肌细胞细胞质、细胞核中Nrf2 蛋白水平（%，±s）

表4 果菊苷处理后各组心肌细胞细胞质、细胞核中Nrf2 蛋白水平（%，±s）

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2.6 Nrf2抑制剂能拮抗松果菊苷对H2O2所致心肌细胞损伤的保护作用 见图5和表5。为明确Nrf2通路在H2O2所致心肌细胞损伤中的作用，本研究在20mg/L松果菊苷处理前30 min，给予H9c2心肌细胞10μmol/L Nrf2抑制剂鸦胆苦醇处理，结果发现与松果菊苷处理组比较，鸦胆苦醇处理后细胞凋亡率明显升高（33.97±4.52%vs 18.08±2.83%，P＜0.05）， 线粒体损伤加重，MMP 显著降低（52.0±3.79%vs 18.33±5.46%，P＜0.05）。

图5 Nrf2抑制剂松对松果菊苷对H2O2所致心肌细胞损伤的保护作用

表5 Nrf2抑制剂对心肌胞凋亡率及MMP的影响（%，±s）

表5 Nrf2抑制剂对心肌胞凋亡率及MMP的影响（%，±s）

与对照组比较，*P＜0.05；与20 mg/L松果菊苷组比较，◇P＜0.05。

组 别 n对照组 4 20mg/L松果菊苷组 4细胞凋亡率 MMP 9.7±1.56 98.3±1.26 19.7±1.75* 51.7±1.96*松果菊苷+Nrf抑制剂组 4 35.9±2.31*◇ 18.9±2.34*◇

3 讨 论

心肌缺血/再灌注损伤是一个复杂病理过程，其发生机制与活性氧增多、钙超载及能量代谢障碍等相关［6-7］。活性氧增多所致细胞凋亡是导致心肌损伤的重要因素［8］。因此，寻找能有效减轻心肌细胞氧化损伤药物，是临床防治I/R损伤亟待解决的问题。

松果菊苷是松果菊、肉苁蓉等植物主要活性成分之一，具有抗氧化等多种活性。研究发现，H2O2会导致细胞发生氧化应激损伤［7］。丁慧等发现，松果菊苷能加快清除氧自由基，降低大鼠脑内氧化应激水平［11］。H9c2心肌细胞是一株成熟细胞系，已广泛用于心肌缺血、氧化应激反应及有效药物筛选等研究［9］。本研究采用100～500μmol/L H2O2处理H9c2细胞，筛选出H2O2最适作用浓度 （300μmol/L），并构建氧化损伤模型。Yan等发现，线粒体膜电位的异常改变可导致心肌细胞凋亡［10］。本研究发现，H2O2处理心肌细胞，细胞凋亡率明显增加，线粒体膜电位显著下降；松果菊苷处理后，细胞凋亡率明显降低，线粒体膜电位显著升高。提示松果菊苷能保护H2O2所致线粒体损伤，抑制H2O2所致心肌细胞凋亡。

受到外界刺激时，细胞膜通透性增加，大量细胞内关键酶CK、LDH及一些代谢产物MDA进入培养基［12-13］。研究发现［14］，红车轴总黄酮能减轻细胞 MDA损伤、减少LDH漏出。本研究发现，H2O2模型组LDH、CK、MDA释放率显著增高。松果菊苷处理后，LDH、CK、MDA释放率明显降低，随着松果菊苷浓度增加，LDH、CK、MDA释放率逐渐降低，提示松果菊苷对心肌细胞膜具有保护作用，可减轻H2O2所致心肌细胞损伤。

研究发现，Nrf2通路激活能保护活性氧所致心肌细胞损伤［15-16］。正常生理状态下，细胞质中Nrf2与Keap1结合，呈无活性状态，受到活性氧等刺激时，Nrf2与Keap1脱离，转移至细胞核而激活，与抗氧化反应元件结合，激活相关基因转录［17］。Tsai等发现，二烯丙基三硫化物能激活Nrf2进而激活PI3K/akt通路，保护高糖诱导的心肌细胞凋亡［18］。Strom发现，Nrf2能与线粒体相互作用，保护线粒体免受H2O2所致氧化损伤［19］。本研究发现，松果菊苷处理后，Nrf2水平在细胞质显著降低，在细胞核显著升高，与贺海波等［20］的发现一致，提示松果菊苷能促进Nrf2向细胞核转移而激活。在20mg/L松果菊苷处理前30 min，给予H9c2细胞10μmol/L鸦胆苦醇处理。结果发现，鸦胆苦醇处理后细胞凋亡率明显升高，线粒体MMP明显降低，表明抑制Nrf2活性能促进心肌细胞凋亡，诱导线粒体损伤。

综上所述，松果菊苷能保护H2O2所致心肌细胞凋亡及损伤，推测其机制是促进Nrf2向细胞核移位而活化，为治疗心肌缺血/再灌注损伤提供新思路。Nrf2向细胞核转移激活后，调节哪些基因转录，产生哪些因子发挥保护作用尚不清楚，将在后续研究中加以研究。

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