血瘀证动物模型制备与思考

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中医证候模型是1960年的邝安堃等在试验中偶然发现大剂量皮质激素能诱发小鼠出现相似于人体阳虚证的征象。直至20世纪90年代，随着医学的发展及现代科学技术的应用，血瘀证动物模型的研究出现井喷式发展，但彼时的动物模型只是单一因素造模，且缺乏诊断标准。2006年田金洲等提出了从“因”“脉”“证”“治”4个思路作为建立血瘀证动物模型的依据，为模型研究提供了新的思路与方法[1]。近年来随着病证结合研究的深入，相继涌现出一批血瘀病证结合模型，为中药药理研究和血瘀证机制研究奠定了实验基础。现对近10年关于血瘀证动物模型的研究概况综述如下。

1 血瘀证模型制备方法

1.1 依据病因制备动物模型

1.1.1 气虚血瘀 《读医随笔》曰：“气虚不足以推动，则血必有瘀。”气帅血行，血瘀多由气虚日久而至。多数学者根据中医“久行耗气、劳则耗气”的原理造成气虚。如黄烁等[2]提出大鼠疲劳跑步运动结合左冠状动脉前降支高位结扎，结果主症、兼症、舌象、脉象、血液流变学、凝血功能等均符合气虚血瘀证候表现，成功建立大鼠气虚血瘀证模型。蔡光先等[3]采取力竭游泳加皮下注射肾上腺素复制气虚血瘀模型，该类模型动物表征符合气虚血瘀证的表现，可见到血液流变学紊乱、凝血指标异常。也有学者采用睡眠剥夺、饮食摄入不足造成气虚。苗兰等[4]采用不可预知的慢性睡眠剥夺复合半高脂高糖饮食成功建立了气虚血瘀中医证候动物模型，模型的血脂代谢紊乱、血液流变学、血管活性分子、心功能等指标符合气虚血瘀证的病机特点。廖慧玲等[5]采取饥饿、高脂饮食、寒湿或惊恐也建立了气虚血瘀证模型，并发现该模型动物血液黏度异常增高，符合血瘀证的病理生理学表现。

1.1.2 寒凝血瘀 《素问·调经论》曰：“血气者，喜温而恶寒，寒则泣不能流”。寒性凝滞，血行不畅而至血瘀。谢波等[6]将大鼠浸泡于冰水环境中，冰水持续刺激15 min～20 min，直至大鼠出现呼吸微弱、腿部僵直、反应迟钝欲沉时取出，每日1次，连续刺激15 d，最后观察血常规、血液流变学、卵巢和子宫指数等指标的变化，建立了寒凝血瘀证动物模型。赵珊珊等[7]采用全身冷冻法造模，将各大鼠独自放置于铁网罩的瓷盘上，置于-20 ℃的低温冰柜中持续受冻1 h，待大鼠出现喜扎堆、反应迟钝、呼吸弱、爪尾部紫暗、唇周发黑等症状时取出，每日1次，最后通过血液流变学、血浆内皮素、一氧化氮、血清促甲状腺素、肾上腺素等指标的变化，证明14 d为寒凝血瘀证大鼠模型最佳冷冻时间。周华妙等[8]采取冰浴法加肾上腺素皮下注射造模。该类动物模型可出现活动减少、进食下降、毛发变黄无光泽、大便溏稀或干结臭秽、体质量增加缓慢、舌质紫暗或有瘀斑等寒凝血瘀表征，也伴有血液流变学、耳温、形态学、凝血系统等指标变化。

1.1.3 气滞血瘀 《血证论·吐血》曰：“气结则血凝”。情志不舒，所欲不遂至肝气郁结，气为血之帅，气滞则血停。梁耀月等[9]采用慢性不可预知性刺激如夹尾、噪声、电刺激、禁食水、昼夜颠倒等建立气滞血瘀模型，大鼠出现血脂水平下降，情志异常，红细胞变形性、心功能均发生异常。任建勋等[10]采用模拟饮食失调结合电刺激、噪声、光建立模型，通过对病因病机的变化以及血管活性分子、血脂、血液流变学等指标的分析，成功复制了气滞血瘀中医证候模型。和岚等[11]注射肾上腺素模拟气滞血瘀大鼠模型，并应用川芎、丹参等药物治疗干预，其结果成功反证建立气滞血瘀证动物模型。

1.1.4 阳虚血瘀 《读医随笔》曰：“阳虚必血凝”。阳气温通血脉，阳气虚则生内寒，内寒则使血液凝滞而血瘀。郑小伟等[12]将大鼠置于瓷盘上，放于-15 ℃的低温冷柜中，持续受冻4 h，至大鼠出现畏寒喜暖、寒战停止、少动、昏昏欲睡、无神、反应迟缓、呼吸微弱、皮毛无光泽、唇黑舌暗、心率减慢时立即脱离冷环境，并通过病理形态学检查成功建立了阳虚血瘀大鼠模型。

1.1.5 痰浊血瘀 若过食肥腻，或情志不畅，致脾失健运而痰浊内生，痰阻血瘀，痰瘀互结。赵玲等[13]给大鼠喂养高脂饮食，采用终点取齐法，结果发现高脂饲养第8周开始，三酰甘油和总胆固醇均升高，红细胞变形系数显著下降，血液呈“黏”“浓”“凝”“聚”状态。

1.1.6 外伤血瘀 《黄帝内经》云：“若有所堕坠，恶疝，恶血，在内而不去，……则气血凝结”。外伤可致血脉受损，血液溢于脉外而为血瘀。华兴邦等[14]将雄性家兔固定在兔台上，用杠杆压力器在右后肢体大腿内侧肌肉加压75 kg，持续1.5 h，然后通过测定肌温、腿径、血流量、血液流变学、病理学检查成功复制了外伤血瘀证动物模型。

1.1.7 热毒血瘀 《读医随笔》云：“血犹舟也，津液者水也。”热邪易伤津液，致津液不足不能载血运行；另血受熏蒸，易瘀塞凝结而致血瘀。卞慧敏等[15]分别采用金黄色葡萄球菌、大肠杆菌内毒素、地塞米松加内毒素3种方法复制“热毒血瘀”证候模型，3种方法在血凝学指标中均表现为凝血酶原时间(PT)、部分激活的凝血活酶时间(KPTT)显著缩短，但在血液流变学指标中则各有不同。

1.1.8 血虚血瘀(脾虚血瘀) 《景岳全书》云：“凡人之气血犹源原也，盛则流畅，少则雍滞。”“气为血之帅，血为气之母。”血虚可致气虚，气虚又可致血瘀。常复蓉等[16]将家兔股动脉放血造成急性失血，放血后24 h、72 h、120 h，3次复测血常规及凝血、血液流变学、球结膜微循环、股动脉血流量、光电容积图波幅、阻抗血流图波幅、超氧化物歧化酶(SOD)、去甲肾上腺素(NE)、血栓素B2(TXB2)、病理形态学等指标，成功复制血虚血瘀模型。

1.1.9 阴虚血瘀 《医学衷中参西录》：“阴虚之甚者，其周身血脉津液，皆就黏稠。”阴津耗伤，血化无源，脉道空虚，血行不利而生瘀；阴虚生内热，血热则聚而成瘀。叶宏军等[17]采取氢化可的松联合肾上腺素建立阴虚血瘀大鼠模型，并予六味地黄汤灌胃，末次给药后1.5 h颈动脉放血检测血液流变学的改变，成功建立了阴虚血瘀证动物模型。

1.1.10 自然衰老血瘀证 《黄帝内经》云：“六十岁，心气始衰，苦忧悲，血气懈惰。”随着年龄增长，机体老化，血液运行迟缓。赵瑛等[18]通过观察对比老年雄性大鼠与对照组在体重、体温、疲劳时间、自主活动、血液流变学等指标上的差异，结果显示，老年雄性大鼠可以作为慢性天然气虚血瘀模型。

1.2 依据病理制备动物模型 近年来，随着中医药“活血化瘀”热，在实验研究过程中发现某些病理状态有典型的血瘀证的症状和体征，目前常用的血瘀证动物模型主要依据血流动力学的障碍、微循环障碍、血液流变异常、血管灌注区缺血和血栓形成以及血管壁损伤等。梁爱华等[19]通过将细菌内毒素(LPS)与角叉菜胶(Ca)复合因素制备模型，造模后24 h观察血栓形成，并于造模后多个时间点分批观察血液流变学指标、微循环变化、凝血及炎症反应指标的变化，成功建立血瘀证动物模型。卞慧敏等[20]将大鼠每日皮下注射D -半乳糖48 mg/kg，第32天开始再予地塞米松1.5 mg/kg肌肉注射，第40天腹腔注射呋塞米1.8 mg/kg。并观察六味地黄汤对血液流变学的影响复制了衰老加阴虚血瘀证动物模型。张允岭等[21]予改良Z -longa线栓法复合多因素刺激复制气滞血瘀证模型，观察模型在表征、舌象、脑组织形态学及血液流变学等指标的变化，建立了气虚血瘀证模型的评价体系。王婷婷等[22]采用注射肾上腺素加声光电、冰水浴、束缚、夹尾的方法复制气虚血瘀证大鼠模型，并采用MOTO压力传感技术检测血液流变学，采取凝固法检测凝血四项。王洪复等[23]将家兔接受丙线照射后出现微循环障碍，并采用芪甲丹注射液反治能改善微循环。王健等[24]于家兔耳缘静脉注射10%高分子右旋糖酐，每周2次，连续10周复制血瘀证动物模型，引起家兔血流速度增快，部分血流停止，眼球结膜微循环变化，微小静脉扩张，微血管周围渗出，血液流变学明显改变等变化。

1.3 病证结合模型 病证结合模型有西医疾患的病理生理特点，同时又有中医证候的症状和表征，是微观和宏观的结合，是实验研究及临床实验的重要载体。谷万里等[25]将大鼠置于笼内，放置于-5 ℃±1 ℃的可调温冰箱中，连续3 h，使大鼠充分暴露于低温环境中，再恢复20 ℃±1 ℃室温，并腹腔注射垂体后叶素20 U/(kg·d)，连续3 d，通过对比造模前后的外观、肛温、耳温、心电图、心脏病理学检查以及血清游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)、游离甲状腺素(FT4)、促甲状腺激素(TSH)、内皮素(ET)、一氧化氮(NO)等指标的变化成功建立了寒凝血瘀心肌缺血病证结合模型。周海哲等[26]采用高脂乳剂1 mL/100 g灌胃，并地塞米松1.5 mg/kg后肢外侧肌注，持续10 d，随即行双侧颈总动脉结扎术，通过对比大鼠行为学、大脑组织中生长抑素(SS)含量，复制了痰瘀互结血管性痴呆模型。刘丹彤等[27]通过自体内膜移植法建立了子宫内膜异位症模型，然后予情志刺激、食用油1 mL/100 g灌胃，并肾上腺素皮下注射，每只0.2 mL，每周1次。随后观察模型行为学表现及外部体征、组织形态学、单胺类神经递质、血管内皮因子的变化，证明通过多因素整合成功建立了子宫内膜异位症气滞血瘀证模型。张明雪等[28]采用高脂饮食、皮下注射垂体后叶素以及寒冷刺激多因素造模，然后进行心电图、心脏彩超、心肌酶、血小板、血脂等检查，成功复制冠心病(心)阳虚血瘀证候模型。聂金涛[29]采取将SD大鼠术前禁食24 h，麻醉后颈部正中切口，分离肌肉和组织后将双侧颈总动脉用4号丝线结扎，缝合后伤口局部注射庆大霉素2 000 U预防感染，并用补肾活血方反证，成功建立血管性痴呆血瘀证大鼠模型。李海霖等[30]将大鼠放置于真空干燥箱内，模拟高原低压缺氧状态，每日3.5 h，此后放置于冰箱中予寒冷刺激3.5 h，共35 d。在此过程中一次性腹腔注射50 mg/kg体重的链脲佐菌素。成模后定时检测血糖，并比较大鼠饮水量、进食量、体重、糖化血红蛋白、血糖、尿微量白蛋白、肌酐、尿素氮、肾脏肥大指数的差别，成功建立了高原阳虚血瘀证糖尿病肾病动物模型。

2 存在问题及思考

当前中医证候模型制备的主要思路包括病因、病理、病因病理结合模型和病证结合模型，而病证结合模型最具实用价值。近年来随着研究的逐步深入，血瘀证动物模型不断充实和改进，但同时也暴露出一些问题。

2.1 优化造模因素，多因素复合造模 中医学的辨证纲领、论治原则、治法、方剂共同构成了中医临床实践的辨证论治体系。而“证候”则是这个体系中的关键。依据中医学“有诸内必行诸于外”的整体观念，证候模型是利用动物某些生物表征来模拟人体证候特征的一类生物表征模型。目前，模型评价指标有以病因为认定依据，有以体征或行为作为评判指标，有学者强调以类血瘀的病理生理指标为依据，也有以方药的反证为依据。成功建立动物模型应满足3个条件：①模型与原型有相似关系；②模型在致病机制、病理表现方面能替代原型；③模型的研究应能得出原型的信息。多因素复合造模，由于既符合血瘀证的诊断标准，也有公认的病理生理指标来支持，应成为制备血瘀证候模型的重要研究方向。

2.2 完善血瘀证模型判断标准 血瘀证覆盖范围很广，内科、外科、妇科、五官科、骨伤科各科疾病都可出现血瘀的病理改变，2011年中国中西医结合学会活血化瘀专业委员会制定《血瘀证中西医结合诊疗指南》。但在造模过程中，因为动物种属差别、制作技术水平的差异、气候环境等主客观因素的影响，目前血瘀证模型制备缺乏规范化、标准化标准。随着动物模型表征的研究，急需完善科学统一的血瘀证模型判断标准。

2.3 深化病证结合模型研究 血瘀证动物模型的研究目的是为临床或药物开发提供支持。多数血瘀证模型是依据中医血瘀证的病因病机或西医的病理生理而建立的，模型的实用性、针对性不足。而病证结合综合考虑了中医病机特点和西医病理特点，符合病证结合研究趋势，临床意义更大。但当前血瘀证病证结合模型研制缓慢，尚需深入研究。

2.4 重视对自发性血瘀证模型的研制 病理性或药物干预性血瘀证候模型虽然部分可模拟中医血瘀特点，但是在形成机制、动物表征方面，与人类血瘀证形成差距较大。随着实验技术的不断发展，充分利用实验动物的特点，通过合理的培育手段，可尝试建立自发性血瘀证动物模型，对血瘀证研究具有较大价值。