三七总皂甙对大鼠海马缺血再灌注损伤的保护作用

缺血性脑血管病以其高发病率、高复发率、高致残率和高死亡率的特点，成为我国居民死亡以及致残的首要原因[1]。脑缺血-再灌注损伤过程极其复杂，涵盖能量代谢失衡、细胞内钙离子超载、酸中毒、兴奋性氨基酸的神经毒性、自由基损伤等多个环节和内在因素的改变，这些因素相互间交叉并关联[2]。研究表明，神经细胞凋亡是缺血再灌注后迟发性神经损伤的主要形式[3]。目前，有研究表明，三七总皂甙（panax notoginseng saponins，PNS）具有降低血脂，增强血脑屏障通透性，清除自由基，抗氧化等保护性作用，并可降低脑梗死体积[4]。PNS的脑保护作用是多方面的，但其具体保护机制仍不完全清楚。本实验建立大鼠缺血-再灌注损伤模型，研究PNS对海马区脑组织凋亡诱导因子（apoptosis inducing factor，AIF）表达的影响，探讨PNS对缺血-再灌注可能的神经保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 健康成年雄性Wistar大鼠68只，随机分为假手术组（4只），生理盐水对照组（16只）和PNS组（48只），PNS（注射用血塞通冻干粉针，昆明制药集团股份有限公司）组又分为3个不同剂量组：小剂量PNS（50 mg/kg）组、中剂量PNS（100 mg/kg）组和大剂量PNS（150 mg/kg）组。生理盐水对照组和不同剂量PNS组再依次按不同给药时间点分为缺血-再灌注后0 h、2 h、4 h和6 h亚组（每亚组4只）。

1.2 动物模型制备和行为学评价 采用改良线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞模型，线栓插入深度为19～22 mm，2 h后拔出栓线10 mm左右完成再灌注。假手术组不插入栓线。再灌注24 h时参照Zea Longa法[5]选择符合采纳条件的大鼠，1～3分者纳入，0分和4分者剔除，并随机补充。参与实验的各组大鼠，在处死前再次进行神经功能评分。

1.3 免疫组化法检测大鼠脑缺血侧海马区AIF表达 脑缺血-再灌注24 h处死大鼠，4%多聚甲醛灌注取脑，多聚甲醛固定24 h，常规酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，每隔100 μm取10张切片，片厚5 μm。切片常规脱蜡至水，3%过氧化氢孵育20 min，磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗5 min×3次，微波修复，切片置于PBS缓冲液，微波炉10 min×2次，时间间隔10 min，自然冷却至室温，滴加一抗（兔抗鼠AIF抗体，北京中杉金桥生物技术有限公司），4℃冰箱中过夜，PBS冲洗3 min×3次，滴加二抗（羊抗兔LgG抗体，北京中杉金桥生物技术有限公司），37℃孵育20 min，PBS冲洗3 min×3次，DAB显色10 min，蒸馏水充分冲洗，苏木素复染1 min，常规脱水透明，中性树胶封片。

组织学观察：镜下AIF阳性表达细胞胞浆、胞膜呈棕黄色或棕褐色。图像检测：400倍光学显微镜下，随机计数缺血侧海马区5个不重复视野的阳性细胞数量并取其均数。

1.4 统计学处理 使用SPSS 19.0统计软件进行数据的统计学分析，定量资料进行正分布性检验，符合正态分布资料以）表示，数据结果采取单因素方差分析，运用q检验进行组间比较。当P＜0.05时表示差异存在统计学意义。

2 结果

2.1 神经功能评分结果 PNS干预组各亚组、生理盐水对照组各亚组与假手术组大鼠神经功能评分比较存在显著差异（P＜0.001），假手术组神经功能评分为0分，提示未出现神经功能缺损。PNS组不同剂量PNS干预组在缺血-再灌注后0 h、2 h、4 h和6 h神经功能评分与相同干预时间点的对照组比较均显著下降（均P＜0.01）。PNS组相同干预时间点，不同剂量PNS组均存在显著差异（均P＜0.01），其中PNS大剂量组最低；PNS相同剂量在不同干预时间点之间未出现显著差异（表1）。

2.2 缺血侧海马区AIF阳性细胞数 PNS干预组各亚组、生理盐水对照组各亚组与假手术组大鼠缺血侧海马区AIF阳性细胞数比较存在显著差异（P＜0.001），假手术组大鼠海马区脑组织AIF阳性细胞表达数为（17.73±2.95）个，显著少于缺血-再灌注后生理盐水对照组和PNS组各剂量PNS组（均P＜0.01）；PNS组相同干预时间点的不同剂量组AIF阳性细胞表达数均显著少于对照组（均P＜0.01），且PNS组相同干预时间点不同剂量组之间AIF阳性细胞表达数均存在显著差异（均P＜0.01），PNS剂量越大，AIF阳性细胞数表达越少，其中大剂量PNS组阳性细胞数最少；而同一剂量PNS组各时间点间AIF阳性细胞数表达均无显著性差异（表2）。

表1 缺血-再灌注24 h大鼠神经功能评分比较（分）

表2 大鼠缺血侧海马区AIF阳性细胞数量比较（个）

3 讨论

脑缺血-再灌注受损区域各个时段均有众多保护及破坏性机制参与，神经细胞凋亡在脑缺血-再灌注后神经损伤机制中发挥重要作用[6]。冯建利等[7]发现神经细胞凋亡程度与缺血-再灌注时间在一定范围内成正比。刘斌等[8]研究发现神经元凋亡与再灌注时间之间存在一定关系。抑制脑缺血-再灌注后神经细胞的凋亡，对于改善缺血性脑血管病的预后具有十分重要的意义。

传统研究认为Caspase的激活在细胞凋亡调控中有至关重要的作用，除此之外，鲜有对细胞凋亡非Caspase的依赖途径机制的相关研究。近年发现，神经细胞凋亡除可通过Caspase依赖途径外，还可通过一些非Caspase依赖途径最终实现。Caspase-3和AIF分别是上述两种途径中的关键物质。AIF是一种不依赖于Caspase的凋亡因子，HONGMIN等[9]认为在N-甲基-D-门冬氨酸诱导的神经细胞凋亡中，AIF可取代Caspase作用。FERRER等[10]发现AIF在脑缺血-再灌注梗死灶周边范围内显著表达，表明在缺血半暗带中AIF能够引起完全不依赖caspase的细胞凋亡。TAO等[11]研究发现，异丙酚通过抑制AIF介导的细胞凋亡起到对全脑缺血再灌注损害的保护作用。因此，通过不同的方式抑制AIF因子的活性或表达，能降低细胞死亡数量，从而达到保护神经元的效能。

PNS是人参属植物三七根部取物中的主要有效活性成分，其成分中涵盖众多单体皂甙。具有降脂，扩血管，延长凝血时间，减少神经细胞在脑缺血发生后胞体内Ca2+、Na+和水含量的作用，同时可以发挥抑制钙超载，减轻脑水肿，改善血脑屏障（blood brain barrier，BBB）的通透性，清除自由基等药理效应，其保护功能主要与能够明显地抑制受损区域及周围的细胞凋亡有关[12]。

本研究结果显示，各PNS组和生理盐水对照组的AIF阳性细胞数量显著多于假手术组，提示缺血-再灌注可上调AIF的表达，引起神经细胞凋亡发生。在不同时间点给予PNS干预后，各用药干预组AIF阳性细胞数量显著少于生理盐水对照组，且随药物剂量的增加AIF阳性细胞表达越少，提示PNS可下调AIF的表达，对缺血-再灌注脑组织有一定保护作用。大剂量PNS组AIF阳性细胞数量最少，Zea longa 5分评分也最低，说明其发挥的保护作用最强。但AIF阳性细胞表达数量在PNS各不同干预时间点未存在显著差异，提示PNS在缺血-再灌注后6 h内干预均具有脑保护作用。研究结果证实了PNS对脑缺血-再灌注损伤的保护机制可能与其干预AIF的作用途径有关，为更好地指导临床用药提供理论依据。

本实验由于时间等客观条件限制，还存在许多不足之处，如大鼠与老年鼠各方面都存在差异，鼠与人体的耐受性及脑血管的形态也存在较大差异，对于药物的耐受性也有不同，缺血性脑血管病也是多种途径、多因素影响的疾病，具体分子机制有待于进一步深入探究。

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