以埃罗替尼为靶向基团的荧光探针在肺癌检测中的应用

周淑敏，宋艳芳，千新来，魏家彬

(1.周口市中心医院病理科，河南 周口 460000；2.新乡医学院基础医学院病理学教研室，河南 新乡 453003)

肺癌是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤，其发病率和病死率呈明显上升趋势[1]。目前，肺癌的早期诊断主要依靠影像学和病理学检查等，前者假阳性和假阴性率较高，且检查费用昂贵，而后者具有创伤性[2]。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)是受体酪氨酸激酶家族中的重要成员之一，与配体表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)结合并发生二聚化后，胞内酪氨酸激酶结构域被激活，通过酪氨酸残基磷酸化等方式激活下游的信号通路，参与细胞的分化、生存、迁移、侵袭、黏附和损伤修复等过程[3-4]。埃罗替尼是小分子酪氨酸激酶抑制剂，属于4-氨基喹唑啉类口服型抗肿瘤药物，主要用于治疗非小细胞肺癌等[5]。埃罗替尼与EGFR的酪氨酸激酶结合具有高度特异性和可逆性的特点。本研究拟以埃罗替尼为靶向基团，制备EGFR胞内区的荧光探针，用于检测EGFR高表达的肺癌等恶性肿瘤。

1 材料与方法

1.1细胞及分组肺癌A-549细胞和宫颈癌CaSki、SiHa、C33-A细胞购于中国医学科学院细胞库，其中将肺癌A-549细胞作为实验组，宫颈癌CaSki、SiHa和C33-A细胞作为对照组。

1.2主要试剂盐酸埃罗替尼购自济南健丰化工有限公司，二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)购自国药集团化学试剂有限公司，胎牛血清购自杭州四季青有限公司，F12K培养基购自美国GIBIO公司，链霉素购自山东齐鲁制药有限公司，青霉素购自华北制药股份有限公司。

1.3以埃罗替尼为靶向基团的荧光探针的制备将0.051 5 g (0.15 mmol)香豆素叠氮化合物(相对分子质量为343.38)、0.059 0 g (0.15 mmol)埃罗替尼(相对分子质量为393.44)和0.005 7 g(0.03 mmol)碘化亚铜(相对分子质量为190.45)加入到10 mL水-四氢呋喃溶液(四氢呋喃水=11)中，氮气保护下，45 ℃下搅拌反应24 h。减压蒸馏除去四氢呋喃，析出固体，过滤，过柱提纯。将二氯甲烷-甲醇(二氯甲烷甲醇=301)作为展开剂。产物的相对分子质量为736.82。

1.4细胞培养及处理方法肺癌A-549细胞和宫颈癌CaSki、SiHa和C33-A细胞用含有体积分数10%胎牛血清、10万U·L-1青霉素和100 g·L-1链霉素的F12K培养基或达尔伯克改良伊格尔培养基，于37 ℃、含体积分数5%CO2的孵箱中培养细胞。取对数生长期细胞，常规消化后，将细胞加入含完全培养基的12孔板，于37 ℃，体积分数5%CO2孵箱中常规培养12 h。

1.5细胞荧光成像(1)探针母液的配制：将0.007 4 g探针分子(0.01 mmol，相对分子质量为736.82)溶解于10 mL DMSO，配制成1×10-3mol·L-1的溶液。(2)细胞荧光成像：取培养的细胞，于培养基中加入小于培养液体积1%的探针母液(加入量)，探针终浓度为0.1×10-6、1×10-6、10×10-6mol·L-1，分别应用此3个不同浓度的荧光探针对肺癌A-549细胞和CaSki、C33A、SiHa细胞进行荧光识别，于倒置荧光显微镜下观察荧光并照相。

2 结果

2.12组细胞在10×10-6mol·L-1探针作用后细胞内荧光信号强弱分布的比较结果见图1。A-549细胞和CaSki细胞中均观察到强荧光信号，而C33A和SiHa细胞中几乎观察不到荧光信号。

A：肺癌A-549细胞；B：肺癌A-549细胞对应的明场；C：宫颈癌CaSki细胞；D：宫颈癌CaSki细胞对应的明场；E：C33A细胞；F：C33A细胞对应的明场；G：SiHa细胞；H：SiHa细胞对应的明场。

图12组细胞在10×10-6mol·L-1探针作用后细胞内荧光信号强弱分布的比较

Fig.1Comparisonofintracellularfluorescentsignalintensitybetweenthetwogroupsafteractionof10×10-6mol·L-1probe

2.22组细胞在1×10-6mol·L-1探针作用后细胞内荧光信号强弱分布比较结果见图2。A-549细胞中可观察到强的荧光信号，C33A中可观察到较弱的荧光信号，而CaSki和SiHa细胞中几乎观察不到荧光信号。

A：肺癌A-549细胞；B：肺癌A-549细胞对应的明场；C：宫颈癌CaSki细胞；D：宫颈癌CaSki细胞对应的明场；E：C33A细胞；F：C33A细胞对应的明场；G：SiHa细胞；H：SiHa细胞对应的明场。

图22组细胞在1×10-6mol·L-1探针作用后细胞内荧光信号强弱分布的比较

Fig.2Comparisonofintracellularfluorescentsignalintensitybetweenthetwogroupsafteractionof1×10-6mol·L-1probe

2.32组细胞在0.1×10-6mol·L-1探针作用后细胞内荧光信号强弱分布比较结果见图3。A-549细胞中可观察到强的荧光信号，而CaSki、C33A和SiHa细胞中几乎不能观察到荧光信号。

A：肺癌A-549细胞；B：肺癌A-549细胞对应的明场；B：宫颈癌CaSki细胞；D：宫颈癌CaSki细胞对应的明场；E：C33A细胞；F：C33A细胞对应的明场；G：SiHa细胞；H：SiHa细胞对应的明场。

图32组细胞在0.1×10-6mol·L-1探针作用后细胞内荧光信号强弱分布的比较

Fig.3Comparisonofintracellularfluorescentsignalintensitybetweenthetwogroupsafteractionof0.1×10-6mol·L-1probe

3 讨论

EGFR作为抗肿瘤药物的靶点，是由原癌基因CerbB编码的具有酪氨酸激酶活性的跨膜受体，抑制EGFR的表达和(或)活性，阻断相关信号转导通路，可抑制肿瘤细胞增殖和新生血管的形成，但对正常细胞影响较小[6-7]。

临床上以EGFR为靶点的治疗策略主要包括2种：(1)针对 EGFR表面的配体结合位点的特异性单克隆抗体，通过作用于EGFR的胞膜外配体结合区，从而竞争性抑制EGFR与其配体EGF的结合，阻断受体活化和相应的信号转导通路，抑制肿瘤细胞的生长；(2)小分子酪氨酸激酶抑制剂，以埃罗替尼为代表的4-氨基喹唑啉类化合物临床应用效果较好，其主要是通过抑制EGFR胞内区酪氨酸激酶活性而发挥作用，即小分子酪氨酸激酶抑制剂可直接作用于酪氨酸激酶结构域的三磷腺苷结合位点，干扰酪氨酸激酶与三磷腺苷的结合，从而抑制酪氨酸激酶的活性，抑制酪氨酸的自磷酸化，由此阻断EGFR的信号转导通路，从而抑制肿瘤细胞的增殖以及新生血管的生成[8]。

埃罗替尼是小分子酪氨酸激酶抑制剂，其与EGFR的酪氨酸激酶结合具有高度特异性和可逆性的特点[9-12]。埃罗替尼口服吸收较慢但效果较好，口服给药150 mg后达到峰值的平均时间为3 h，最高血药浓度约为(1.136±0.865)×10-3g·L-1，生物利用度约为80%，血浆蛋白结合率约为90%～95%[13]。

肺癌的早期诊断日益受到重视，EGFR在多种恶性肿瘤细胞中呈高表达状态，如肺癌、胃癌、头颈部肿瘤等，EGFR突变状况可为临床提供及时、准确的靶向治疗，而盐酸埃罗替尼作为胞内区的肿瘤靶向药物，可特异性的与EGFR结合。本研究以埃罗替尼为靶向基团，制备EGFR胞内区的荧光探针，用于检测EGFR高表达的肺癌等恶性肿瘤。

本研究分别用10×10-6、1×10-6、0.1×10-6mol·L-1的以埃罗替尼为靶向基团的荧光探针对肺癌A-549细胞和宫颈癌CaSki、SiHa、C33-A细胞进行荧光识别，当探针浓度为10×10-6mol·L-1时，A-549细胞和CaSki细胞中均观察到强的荧光信号；当探针浓度为1×10-6mol·L-1时，A-549细胞中仍可观察到强的荧光信号，C33A中可观察到较弱的荧光信号，而CaSki和SiHa细胞中几乎观察不到荧光信号。为了避免实验出现的弱荧光产生假阳性判断，本研究用更低浓度0.1×10-6mol·L-1的探针来与细胞共孵育，观测C33A细胞是否能被探针分子识别。结果发现，A-549细胞中仍可观察到强的荧光信号，而CaSki、C33A和SiHa细胞中几乎观察不到荧光信号。

综上所述，以埃罗替尼为靶向基团的荧光探针可用于检测A-549细胞，但是本研究只是初步的结果，该结果是否能够用于临床尚需进一步研究来证实。

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