RANK信号调控破骨细胞分化与成熟的研究进展

梅良伟 桑文华 陈富春 李晓春 王登峰 吴卓 穆佐洲 邵海龙

1.陕西省第四人民医院骨科，陕西 西安 710043 2.陕西省第四人民医院病理科，陕西 西安 710043

健康骨骼通过骨的重塑来维持，首先由破骨细胞行使骨吸收功能形成骨吸收陷窝，接着成骨细胞在腔隙内重新成骨，这是一个动态平衡的过程[1]。因此，破骨细胞和成骨细胞的结合在空间和时间上都受到严格的调控。破骨细胞是一种具有骨吸收功能的多核巨细胞，其主要来源于骨髓中形成的造血前体细胞。M-CSF和RANKL由成骨细胞或骨细胞表达，为破骨前体细胞分化为成熟破骨细胞所必需[2]。M-CSF刺激破骨前体细胞表面表达RANK(由Tnfrsf11a编码)，进而使RANKL与其受体RANK结合。Tnfsf11或Tnfrsf11a基因缺失的小鼠表现为严重的石骨症，同时伴有因破骨细胞完全死亡而导致的牙齿脱落缺陷[3]。RANKL-RANK信号也受到骨保护素(osteoprotegerin,OPG)(Tnfrsf11b编码)的负调控，OPG是RANKL的一个可溶性诱导受体，能够阻碍RANKL与RANK的结合[4]。

RANK是肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的一名成员，它缺乏激活下游信号分子所需的内在酶活性。因此，RANK必须通过募集配体分子例如TNFR相关性因子(TRAFs)，进而激活MAPKs和NF-κB传导细胞内信号[5]。RANK信号调控下游信号，从而导致单核细胞/巨噬细胞前体细胞向破骨细胞谱系的分化和成熟破骨细胞的激活。

在RANK信号的起始步骤，RANKL与相应的受体RANK结合导致衔接蛋白如TRAF6的募集，从而形成RANK三聚体，同时快速激活MAPKs、NF-κB和AP-1[6]。继而通过激活AP-1和协同刺激信号介导的细胞内Ca2+振荡，放大 NFATc1进行信号传递[7]。最终，活化的NFATc1促使破骨细胞基因转录从而调控破骨细胞的多核和骨吸收功能。本文中笔者主要阐述目前已知的在这一过程中所涉及的分子机制，以及近期关于RANK信号调控破骨细胞的新发现。

1 RANK信号和TRAF衔接蛋白

RANKL与RANK结合促使RANK形成三聚体并募集衔接蛋白—TRAF6，从而启动下游信号的级联放大反应。TRAF家族的其他成员如TRAF2、TRAF3和TRAF5，也可以与RANK结合激活破骨细胞分化所需的转录因子。然而，对TRAF6缺陷小鼠的研究[8]表明，TRAF6是主要的衔接蛋白，主要负责RANKL激活引起的信号级联反应。活化的TRAF6通过激活IκB激酶(IKK)复合体或者非典型蛋白激酶C(aPKC)或TGFβ活化激酶1(TAK1)依赖的磷酸化刺激NF-κB的激活，同时这也是一个需要IKKγ(也被称为NEMO)泛素化以实现最佳激活的过程[9]。支架蛋白p62结合到TRAF6并与aPKCs相互作用，导致多聚蛋白复合物的形成并调节IKKβ[9]。TRAF6还可与TAK1、衔接蛋白TAK1结合蛋白1(TAB1)和TAB2形成复合物[10]。激活后，TAK1使IKK复合物磷酸化，从而进一步激活NF-κB通路[11]。NF-κB信号对破骨细胞的形成至关重要，有研究表明，NF-κB p50/p52双敲除小鼠因无法生成破骨细胞而表现出严重的骨硬化性疾病[12]。AP-1转录因子包括Fos(c-Fos、FosB、Fra-1和Fra-2)、Jun(c-Jun、JunB和JunD)和ATF(ATFa、ATF2、ATF4和B-ATF)家族成员的激活也是通过衔接蛋白诱导c-Fos实现[13]。c-Fos基因敲除小鼠表现为严重的骨硬化病[14]。这些结果表明，转录因子如NF-κB和AP-1是早期RANKL信号通路重要的下游靶点。衔接蛋白的募集也导致MAPKs的激活，包括c-Jun氮端激酶(JNK)、p38、细胞外信号调节激酶和Akt/PKB[15]。近期有研究[16]发现，激活的C激酶1受体(RACK1)为Trp-Asp40(WD40)重复蛋白家族的一名成员，是破骨细胞分化的必要条件。RACK1充当支架蛋白将TRAF6-TAK1复合物与MKK6而不是MKK3相结合，通过选择性地促进p38的激活在RANKL诱导的破骨前体细胞向破骨细胞分化过程中起重要作用。此外，考虑到RACK1在RANKL诱导下的表达方式及其与β1、β2整合素亚单位和c-Src之间的关系，RACK1可能参与到破骨细胞的骨吸收功能阶段。其他研究[17]表明，Akt、JNK和NF-κB通路的激活需要生长因子受体结合蛋白2(Grb2)—相关性结合-2(Gab2)。此外，磷脂酶Cγ2(PLCγ2)与Gab2形成复合物进而使Gab2磷酸化，同时调节RANK募集Gab2。Lee等[18]的研究表明RANK-TRAF6-Rac1-NADPH氧化酶1依赖途径产生的活性氧是MAPK激活和破骨细胞形成的必要条件。

2 共刺激信号

在初始阶段NF-κB、c-Fos/AP-1和NFATc2诱发NFATc1后，RANK信号与免疫球蛋白样受体/免疫受体酪氨酸活化基序(immunoglobulin-like receptor/immunoreceptor tyrosine-based activation motif,ITAM)信号共同作用，这导致NFATc1的瀑布样放大并且移位入核结合到DNA上联同其他转录因子一起上调NFATc1靶基因的转录[19]。大量的体内研究证明了NFATc1在破骨细胞形成中的重要作用。在动物实验中，破骨细胞特定NFATc1条件性敲除小鼠表现出骨硬化和破骨细胞形成抑制[20]。此外，NFATc1不仅调节破骨细胞活性和骨形成，还调节其他生物系统中细胞的活化和发育，如免疫系统、心血管系统和骨骼肌系统[21]。

除了RANK信号，免疫球蛋白样受体如2型髓系细胞触发受体(triggering receptor expressed in myeloid cells-2,TREM-2)和破骨细胞相关受体(osteoclast-associated receptor,OSCAR)也可以诱导NFATc1信号[22]。这些免疫受体具有短细胞质尾的特点，并且与衔接蛋白如DNAX-活化蛋白12(DNAX-activation protein 12,DAP12)或Fc受体共同的γ亚基(Fc receptor common γ subunit,FcRγ)相关联，其中就包含ITAM[19]。当ITAM由于RANKL的刺激发生酪氨酸磷酸化时，一个含有酪氨酸激酶的复合物便形成，这些酪氨酸激酶包括布鲁顿酪氨酸激酶(Bruton’s tyrosine kinase,Btk)/Tec、衔接分子B细胞连接蛋白(adaptor molecules B cell linker protein,BLNK)和SLP-76，这些复合物将RANK和ITAM下游信号融为一体，最终激活PLCγ2的磷酸化[23]。Btk和Tec缺陷小鼠由于破骨细胞分化被破坏、RANKL诱导的PLCγ2酪氨酸磷酸化高度抑制而表现为骨硬化表型[23]。同时，由于Btk和Tec缺陷，使得RANKL诱导的Ca2+振荡在细胞内消失。这表明，Btk和Tec对破骨细胞形成至关重要，并且这些激酶通过PLCγ2和Ca2+信号通路调节NFATc1的激活。当DAP12和FcRγ缺乏时，在细胞内无法检测到Btk/Tec和BLNK/SLP-76复合物的形成，这表明Tec激酶和BLNK复合物的形成均需要ITAM信号的激活，该复合物可作为连接RANK和ITAM信号的分子开关。近期一项研究[24]表明，在破骨细胞形成过程中由RANKL刺激产生的早期雌激素基因1(EEIG1)能够与RANK相互作用，并且RANKL刺激后与Gab2、PLCγ2和Btk/Tec激酶相连接。EEIG1敲除导致RANK诱导的破骨细胞形成明显减少，这是因为RANKL介导的PLCγ2的活化和NFATc1的产生被抑制所引起。在RANKL的刺激下，RANK形成了包括EEIG1、Gab2、PLCγ2和Btk/Tec在内的信号复合物，这表明，EEIG1为一种衔接蛋白同时也是RANK和ITAM信号的连接蛋白[24]。

PLCγ2也通过其高度保守域与RANK相互作用，并且与Gab2和TRAF6形成复合物，从而表现为一种信号依赖方式的磷酸化。ITAM信号与RANK信号一起介导长期的感应性PLCγ2激活。活化的PLCγ2通过分解磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸产生1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)，IP3与内质网(ER)表面的IP3受体结合。因此，储存在内质网中的Ca2+被释放到胞质中，并诱导产生Ca2+振荡[25]。NFATc1的诱导也受其亚细胞定位的调控，这依赖于其丝氨酸残基的磷酸化[26]。在缺乏RANKL刺激的条件下，NFATc1主要由位于细胞质中的活性糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)磷酸化。当RANK信号在其抑制性丝氨酸残基(GSK-3β的Ser9)处诱导GSK-3β磷酸化后，GSK-3β即被灭活。这使NFATc1通过钙依赖磷酸酶去磷酸化，随后转移进入细胞核。在细胞核中，NFATc1诱导靶基因的表达。在破骨细胞过表达GSK-3β的突变型转基因小鼠中，由于体内破骨细胞数量的减少以及体外破骨细胞形成和NFATc1感应受损而表现出骨硬化病[27]。此外，抑制3-磷酸肌醇激酶可以降低破骨细胞的形成，减弱NFATc1的表达。GSK-3β因磷酸化增加而失活，Akt在破骨细胞前体中过表达也可以引起NFATc1的表达及其核定位。最近的一项研究[28]表明，PKCβ通过灭活GSK-3β调控NFATc1的激活，从而导致破骨细胞生成。这些结果表明，在破骨细胞分化过程中，GSK-3β/NFATc1级联信号在RANK信号通路内具有重要作用。

3 破骨细胞分化晚期的主要信号

在RANK信号后期，扩增的NFATc1激活和诱导破骨细胞特异性基因表达，这些基因能够编码与破骨细胞分化、融合和功能相关的蛋白。此外，在破骨细胞分化过程中，NFATc1的正性或负性调节因子得到增强或抑制。在RANKL诱导的破骨细胞分化过程中，负性调节因子的表达下调：v-maf肌肉筋膜纤维肉瘤癌基因家族、蛋白B(MafB)、干扰素调节因子-8(IRF8)以及B细胞淋巴瘤6(Bcl6)等在破骨细胞分化过程中抑制NFATc1表达[29-31]。所有负性调节因子都被转录抑制因子B淋巴细胞诱导的成熟蛋白1(Blimp1)下调[32]。在破骨细胞分化过程中，Blimp1是由RANKL刺激引起的，而在破骨细胞中缺乏Blimp1的小鼠，由于破骨细胞严重破坏而表现出骨硬化表型[33]。最近有研究结果[32]表明，sirtuin 6(Sirt6)是一种核组蛋白去乙酰化酶，通过Blimp1直接抑制抗破骨基因的表达。在造血细胞中，Sirt6的特异性消融可以通过降低破骨细胞的分化而增加骨体积。RANKL诱导的NFATc1上调了Sirt6的表达，而诱导的Sirt6通过抑制MafB与Blimp1的结合，对NFATc1的转录产生了积极的调控作用[32]。因此，NFATc1通过诱导其靶基因Blimp1和Sirt6的表达来维持其自身的表达，并下调负调节因子的表达。

树突状细胞特异性跨膜蛋白(DC-STAMP)、液泡质子泵亚单位Atp6v0d2和c-Src底物Tks5等几种蛋白参与破骨细胞间的融合；其表达受NFATc1与PU.1、小眼畸形相关转录因子(MITF)和c-Fos的调控。DC-STAMP缺陷型小鼠表现为中度的骨硬化，这与大量TRAP阳性破骨细胞不同的是虽具有骨吸收功能，但吸收能力不完全[34]。同样，Atp6v0d2缺陷型小鼠由于缺乏多核TRAP阳性破骨细胞也表现为中度骨硬化；然而，这些小鼠主要是单核TRAP阳性细胞[35]。αVβ3，一种整合素受体，能够与骨基质中的维甲酸结合，通过募集c-Src酪氨酸激酶的合成导致骨吸收[36]。接下来，c-Src使Syk磷酸化，Syk通过募集DAP12和SLP-76形成衔接蛋白复合物，激活包括Rac在内的小Rho家族GTP酶。这些相互作用通过溶酶体分泌囊泡与细胞质膜融合，导致皱褶边界膜的形成。至于骨吸收，H离子通过皱褶边界被泵出，并与Cl离子形成HCl将骨基质分解，同时激活各种水解酶如蛋白酶K、CLC-7氯离子通道和TRAP[7]。

Kim等[37]认为，细胞质内的RANK通过调节破骨细胞的肌动蛋白骨架和存活，特异性地参与破骨细胞的形成和功能。他们使用了一种细胞通透性RANK受体抑制剂(RRI)靶向作用于细胞质内的RANK。RRI肽可阻断RANKL诱导的破骨细胞形成，并通过Vav3、Rac1和细胞分裂周期42破坏下游RANK信号，从而破坏破骨细胞形成过程中产生的肌动蛋白环。此外，RRI抑制破骨细胞的骨吸收作用和增强破骨细胞的凋亡。RRI肽并不能消除任何TRAF6介导的蛋白激酶级联反应，亦不能改变NFATc1和破骨细胞特异性基因的表达。这些结果表明，RRI肽作用于NFATc1和破骨细胞形成的高度特异性调控之后，主要作用于破骨细胞形成的晚期，而不影响参与免疫信号等多种信号通路的其他信号分子。

4 总结

RANK信号是调控破骨细胞分化和功能的关键分子信号。这一发现使破骨细胞在体外培养过程中能够产生几乎纯合的种群，从而促进了对包括细胞分化和功能在内的细胞内机制和信号网络的解析。该信号始于RANKL与RANK的结合，并通过募集大量的衔接蛋白如TRAF6和激酶形成一系列的信号复合物，从而促进信号转导的调节。RANK信号与免疫受体/ITAM信号相互作用，这是破骨细胞生成所需的另一个信号通路。RANKL信号与ITAM介导的Ca2+信号一起，最终诱导NFATc1的扩增和破骨细胞相关基因的表达。正因如此，针对这些信号的分子药物，不仅会抑制破骨细胞的生成，也可能对其他系统如免疫系统造成影响，探讨破骨细胞生成、分化及功能的机制，寻找真正的特异性靶基因及靶分子尤为关键。然而，关于共同分子的调节以确保破骨细胞形成所需的特定信号转导方式尚不清楚。因此，通过对RANK信号通路机制的探讨，TRAF6、ITAM、Ca2+以及NFATc1等作为调控破骨细胞分化与成熟的潜在新靶点，将为今后骨科相关疾病的诊治和药物研发提供新的选择。