骨靶向治疗研究进展

谭乔燕 谢杨丽 李灿 罗凤涛 陈林

陆军军医大学大坪医院康复理疗科/骨代谢与修复中心/全军战创伤中心创伤实验室/创伤、烧伤、复合伤国家重点实验室，重庆 400042

骨骼不仅是生物体重要的力学支持器官，也是机体的钙磷库，对维持体内钙磷的稳定发挥重要作用。骨形成过程中，间充质干细胞的增殖和密集，然后逐步分化为成骨细胞，成骨细胞分泌类骨质，并被包埋其中，成为骨细胞，继而类骨质钙化成骨基质，最后形成骨组织。成骨过程中，成骨细胞还可以通过分泌核转录因子受体、骨保护素和巨噬细胞集落刺激因子等来调控破骨细胞的分化和激活。骨重建是维持成年期骨代谢和力学功能的重要机制，需要成骨细胞诱导的骨形成作用和破骨细胞诱导的骨吸收间的动态平衡来实现。任何一方数量或功能的变化必然破坏骨代谢的动态平衡，影响骨代谢，严重时可引起骨质疏松、佩吉特病、转移性骨肿瘤等疾病[1]。

1986年Pierce等[2]首次提出“骨靶向”概念。为骨骼相关疾病的治疗提供了新策略。靶向递送不仅提高药物利用率，还能减轻药物毒副作用。本文根据靶向目标不同将骨骼靶向药物递送系统分为两种，一种是靶向整个骨组织；另一种是靶向骨组织里的细胞。

1 靶向骨组织

骨组织干重的35%是天然有机成分胶原，其余主要由无机羟基磷灰石[Ca10(PO4)6(OH)2,HA]构成[3]，所含钙占人体总钙量的99%。部分化合物分子可掺入HA同骨组织中钙结合，从而沉积于骨。因此，凡与HA有特异亲和力的物质，都可作为骨组织靶向药物或靶向载体，从而使药物能特异性地作用于骨组织。

1.1 四环素类(tetracyclines,TCs)

TCs通过替换HA中的2个PO43-，与Ca2 +络合形成金属配合物，从而沉积于骨组织并掺入到新生骨或牙齿中。Wang 等[4]将聚乳酸-羟基乙酸共聚物[Poly(lactic-co-glycolic acid,PLGA)]的末端羧基与骨靶向基团TC的羟基进行酯化反应得到TC-PLGA复合物，异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记TC-PLGA发现纳米粒能较好的被靶向组织摄取，在骨组织中的分布比普通纳米粒提高80.6%。此外，TCs也可连接药物作为骨靶向药物的载体。如将四环素中三羰基甲烷环A与雌二醇结合，三羰基甲烷环A选择性结合雌激素受体α，从而将雌二醇传递并聚集在骨组织，减少其在非骨组织的蓄积与作用，提高雌二醇治疗绝经后骨质疏松的安全性[5]。

1.2 双膦酸盐类 (bisphosphonates,BPs)

BPs是天然焦磷酸的类似物，分子结构中的两个末端磷酸键(P-C-P)是靶向骨组织的必要条件。 磷酸基对钙化组织有较强亲和力，可与骨表面HA有效结合，抑制HA的继续形成、聚集及溶解，从而抑制骨吸收[6]，因此，BPs可作为药物单独用于治疗骨质疏松症、佩吉特病及转移性骨肿瘤等骨吸收增多性疾病[1]。但使用前对肾功能的要求及其可能导致的肾毒性、颌骨坏死、骨关节疼痛等症状在一定程度上限制了其临床应用。因此，迫切需要对BPs进行修饰提高其利用率。纳米粒是研究比较成熟的药物载体，由于其亲水表面和小粒径特性，一方面使其避免巨噬系统的吞噬识别；另外还可延长其在血液中的循环时间。Katsumi等[7]研究发现阿仑膦酸经聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)纳米粒包裹后显著提高在血液中的循环时间和靶向骨的能力。Rawat 等[8]将BPs经PEG-PLGA纳米粒包裹后作用于骨质疏松动物模型，发现BPs毒性降低，骨质疏松治疗疗效提高。此外，BPs还可作为靶向载体与各种药物分子连接形成骨组织的靶向药物。如Sedghizadeh 等[9]将BPs结合环丙沙星形成偶联物BV600022，体外研究发现通过调节pH值，BV600022缓慢释放环丙沙星，起到持续抑菌效果，进一步利用假体骨髓炎大鼠模型发现单次小剂量(10 mg/kg)腹腔注射BV600022可达到与三次大剂量(30 mg/kg)注射环丙沙星相同的抑菌效果。

1.3 仿生蛋白类

1.3.1胶原结合区 (collagen binding domain,CBD):骨骼有机成分中I型胶原占了绝大部分，多种蛋白如甲状旁腺激素(parathyroid hormone,PTH)、基质细胞衍生因子-1α(stromal cell-derived factor 1α,SDF-1α)可通过与CBD结合，进而靶向骨骼。Ponnapakkam等[10]将PTH与CBD融合后单次腹腔内注射可显著提高小鼠的骨密度。在大鼠股骨缺损模型中，CBD-SDF-1α与脱钙骨基质支架结合植入缺损部位3 d，发现CBD-SDF-1α可募集C-kit和CD34阳性的内源性干细胞归巢，显著促进骨重塑[11]。

1.3.2小肽类:骨形成表面覆盖成骨细胞以低晶体化的磷灰石为主，而骨吸收表面覆盖破骨细胞以高晶体化的磷灰石为主[12]。牙本质磷蛋白是牙本质胞外基质中的一种主要非胶原蛋白，在牙齿发育过程启动牙本质矿化和调节HA晶体生长速度中起重要作用，根据牙本质磷蛋白序列合成系列对钙磷有较高亲和力的小于25个氨基酸的肽，以多次重复三肽Asp-Ser-Ser(DSS)n为特征，与HA 的亲和力随(DSS)n重复次数成正相关[13]。进一步研究发现(DSS)6[14]特异与低晶体化的磷灰石结合从而靶向于骨形成表面。根据与HA可能结合位点处重复氨基酸序列(Asp or Glu)，合成与HA特异结合的非胶原蛋白(Asp)6[15]和(Asp)8[16]，用FITC作标记(Asp)6，大鼠静脉注射(Asp)6-FITC后24 h取材，发现骨骼和牙齿均有荧光标记，而软组织中无荧光标记，且血液中(Asp)6-FITC的半衰期由FITC的1 h延长到14 d。进一步研究发现(Asp)6和(Asp)8小肽特异与高晶体化的磷灰石结合从而靶向于骨吸收表面。

1.4 放射性药物类

对于广泛性肿瘤骨转移出现的严重骨疼痛，放射性核素导向治疗是近年来发展较快、疗效较好的一种手段。如Strontium、Lanthanides 等亲骨性放射性核素，由于与钙类似的物理及化学特性，吸收后优先沉积于骨组织，并参与骨矿物质的代谢过程[17]。89SrCl2是FDA批准的第一个缓解骨转移的放射性药物，Strontium模拟钙聚集在转移部位，诱导矿化过程中骨细胞周围胞外基质的聚集，提高成骨细胞活性及骨形成能力[18]。

2 靶向细胞

由于药物无法分辨骨组织里的不同细胞，在治疗过程中，靶向骨组织的药物递送将作用于所有细胞。因此，迫切需要更为精确与安全的靶向细胞的递送系统。

2.1 靶向成骨细胞

核酸适配子是一类广泛应用于药物靶向递送的单链寡核苷酸。2015年，Liang等[19]利用指数富集的配基系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)，以大鼠原代成骨细胞和人原代成骨细胞为靶标，大鼠肝细胞系BRL-3 A和PBMCs为消减靶子，成功筛选到靶向成骨细胞的核酸适配子CH6，结合脂质体纳米粒包被Plekho1基因(成骨基因pleckstrin同源性家族O成员1)的siRNA，体外实验发现CH6-LNPs-siRNA促使成骨细胞通过巨胞饮选择性摄取Plekho1 siRNA。在健康与卵巢切除大鼠骨质疏松模型中，CH6可加强成骨细胞特异性的Plekho1基因沉默，促进骨形成及改善骨微结构，最终实现卵巢切除大鼠的骨量增加及骨骼机械性能恢复。

多肽由于空间结构简单，分子量小，特异性高，渗透力强，且不易被酶类识别和降解，免疫原性低等特点，已被广泛应用于药物靶向递送。Sun等[20]利用噬菌体展示技术，以小鼠成骨细胞系MC3T3-E1和人成骨细胞系hFOB1.19为靶标，筛选到特异靶向小鼠和人成骨细胞的多肽Ser-Asp-Ser-Ser-Asp (SDSSD)，通过亲和色谱法和细胞结合实验，进一步发现SDSSD多肽与成骨细胞特异因子2有较高亲和力，结合聚氨酯 (Polyurethane,PU) 纳米胶束包被anti-miR-214，建立靶向成骨细胞的核酸递送系统，发现SDSSD-PU将anti-miR-214特异性递送至骨形成面的成骨细胞，进而促进骨形成，改善骨骼力学性能。

2.2 靶向破骨细胞

破骨细胞表面的粘附分子整合素αVβ3，通过精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列在破骨细胞黏附至骨基质及骨吸收活性发挥中起重要作用。整合素αVβ3能激活巨噬细胞依赖的炎症反应，促进破骨细胞的发育、迁移，骨吸收及炎症形成。MEDI-522(又名Vitaxin)是一种与αVβ3亚基特异结合的人源性单克隆抗体，在风湿性关节炎动物模型中，发现Vitaxin能阻止整合素αVβ3与其各种配体如骨桥蛋白和玻连蛋白的结合，抑制破骨细胞的发育进而阻止后续炎症形成及骨吸收作用[21]。

miRNA在调节骨稳态中起重要作用。老年女性骨折及卵巢切除小鼠的骨形成减少与破骨细胞miR-214-3p增高导致的血清外泌体miR-214-3p增高直接相关，miR-214-3p通过结合成骨转化因子抑制成骨细胞的活性和基质矿化。使用D-Asp8将miR-214-3p 拮抗剂靶向破骨细胞可抑制其miR-214-3p的表达，继而促进卵巢切除衰老小鼠骨形成[22]。

2.3 靶向骨细胞

早期肿瘤骨转移过程中，乳腺癌细胞通过分泌甲状旁腺激素相关蛋白刺激骨细胞释放核转录因子受体、骨保护素和硬骨素，进而调控破骨细胞生成和加速肿瘤骨转移。Qiao等[23]研究发现唑来膦酸对早期肿瘤骨转移部位骨细胞有较高亲和力，唑来膦酸和白花丹素可协同作用缓解肿瘤转移引起的骨破坏。唑来膦酸和白花丹素结构模拟三磷酸腺甘酸竞争抑制成骨细胞环磷腺苷效应元件结合蛋白、细胞外调节蛋白激酶和氨基末端激酶的磷酸化，从而抑制转移微环境内骨细胞分泌核转录因子受体和硬骨素[24]。进一步研究建立了pH响应的靶向骨细胞药物递送系统，以唑来膦酸为靶头并载药白花丹素的纳米颗粒PUCZP，研究发现PUCZP靶向骨细胞，pH响应释放白花丹素，抑制成骨细胞诱导破骨细胞生成及骨溶解，从而抑制肿瘤骨转移[25]。

2.4 靶向干细胞

Iwagawa等[26]通过消减SELEX技术，以小鼠胚胎干细胞系为靶标，小鼠皮下结缔组织细胞系A9为消减靶子，L1-65为竞争适配体，筛选到靶向小鼠胚胎干细胞的核酸适配子，通过MPBind从已有适配子序列中分析预测得到8种和人诱导多能干细胞特异结合的核酸序列[27]，选择亲和力最高的序列Apt19进行系列平截，得到特异靶向诱导多能干细胞的核酸适配子Apt19S[28]。在骨软骨缺损模型中，Apt19S结合双层支架可募集内源性间充质干细胞从骨髓到缺损部位， 分别促进间充质干细胞向软骨细胞和成骨细胞分化，显著提高缺损修复能力[29]。

间充质干细胞表达多种整合素亚基，如α1、2、3、4、6、11、CD51(αV)和CD29(β1)，成骨细胞表达整合素β1亚基，间充质干细胞过表达整合素α4亚基可促进干细胞的募集及向成骨细胞分化[30]。Yao等[31]发现，小分子多肽模拟物LLP2A可有效结合间充质干细胞表面整合素受体α4β1，LLP2A与阿伦膦酸钠 (Alendros,Ale)结合制成肽模拟复合物LLP2A-Ale，可促进间充质干细胞迁移和成骨分化能力。在异种移植和具免疫活性小鼠中，单次静脉注射LLP2A-Ale可显著促进股骨和脊柱骨小梁的形成。此外，LLP2A-Ale还可防止雌激素缺乏引起的小梁骨丢失，进而提高骨密度和骨量。

3 讨论与展望

综上所述，新型靶向细胞特异性递送系统，理论上可以将具有治疗效应的药物通过精准识别来实现细胞特异性递送，从而推动靶向药物的研发。骨性关节炎为关节慢性进行性病变，是以关节软骨退化、变性和继发的软骨增生、骨化为主要病理变化的一种疾病，由于关节软骨内无血管、神经及淋巴管，关节软骨的自我修复能力极差。目前国内外对骨性关节炎的研究较多，但仍缺乏能有效安全防治骨性关节炎的药物。

IL-17/IL-17RA介导炎症因子IL-1、6、8的信号转导，调控蛋白水解酶活性，促进基质降解，参与关节炎的发生。Chen等[32]通过SELEX技术，以NIH3T3细胞系为对照，IL-17RA-缺陷的NIH3T3细胞系为靶标，筛选到特异结合IL-17RA的核酸适配子RA10-6，在大鼠内侧半月板不稳定手术诱导的关节炎模型中，关节腔注射适配子RA10-6可有效缓解关节炎引起的滑膜增厚表型，这是建立在已知靶分子基础上的靶向细胞治疗。目前仍未见直接靶向软骨细胞的相关报道，因此，筛选早期靶向关节炎样细胞的适配子，有助于防治骨性关节炎药物的研发。