可溶型小鼠细胞因子LIGHT/TNFSF14的原核表达、纯化及活性验证

颜晓庆 刘飞 刘庆亚 寇艳波

【摘要】 目的：前期研究发现小鼠细胞因子LIGHT（TNFSF14）能够抑制脂肪前体细胞分化，表达纯化LIGHT并验证其活性，将为进一步明确其调控脂肪前体细胞分化的机制提供坚实的基础。方法：以小鼠脾脏总cDNA为模板，通过PCR扩增得到LIGHT胞外段编码序列，并将其克隆至pGEX4T-1，经菌液PCR、限制性内切酶酶切及测序验证后获得重组质粒pGEX4T-1-LIGHTc。重组质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导蛋白表达后SDS-PAGE检测菌体破碎液上清中可溶型LIGHTc的存在。含有重组蛋白的上清经亲和纯化后获得GST-LIGHTc重组蛋白，重组蛋白经凝血酶消化后得到游离型LIGHTc单体，最后通过结肠癌细胞生长抑制实验验证LIGHTc单体的活性。结果：通过大肠杆菌异源表达和亲和纯化获得了GST-LIGHTc重组蛋白，经凝血酶处理后得到有活性的游离型小鼠LIGHT蛋白。结论：通过大肠杆菌异源表达及亲和纯化获得有活性的小鼠LIGHTc重组蛋白，为进一步研究LIGHT影响脂肪前体细胞分化的分子机制奠定了重要的材料基础。

【关键词】 LIGHT； 肿瘤坏死因子； 异源表达纯化； 亲和纯化

【Abstract】 Objective：In our previous research，we find the murine LIGHT（TNFSF14） can inhibit preadipocytes differentiation to mature adipocytes.To futher illuminate the mechanism how LIGHT inhibits preadipocytes differentiation，the extracellular section coding sequence of LIGHT was cloned and heterologously expressed in E.coli.Method：The LIGHT coding sequence was amplified from spleen total cDNA by PCR and then cloned into prokaryotic expression vector pGEX4T-1.After verified with restriction enzyme digestion and sequencing，the recombinant plasmid was transformed into E.coli BL21.The transformed BL21 was treated with IPTG to induce the expression of recombinant protein GST-LIGHTc.Before activity detection，the GST-LIGHTc protein was digested by thrombin to aquire dissociated LIGHTc.Result：Gst-lightc recombinant protein was obtained by heteroexpression and affinity purification of escherichia coli，and the active free mouse LIGHT protein was obtained by thrombin treatment.Conclusion：The soluble recombinant murine LIGHTc with biological activity is obtained with E.coli heterologous expression and affinity purification.This will lay the foundation for illuminating the mechanism of LIGHT regulating preadipocytes differentiation.

【Key words】 LIGHT； TNF； Heterologous expression； Affinity purification

First-authors address：Xuzhou Medical University，Xuzhou 221004，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.32.007

LIGHT[Lymphotoxin-like，exhibits inducible expression，competes with Herpes Simplex Virus Glycoprotein D for Herpesvirus Entry Mediator（HVEM）receptor expressed by T lymphocyte]屬于肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）超家族，又称TNFSF14，广泛表达于全身各个组织和器官，在活化的T细胞和未成熟树突状细胞中呈现高表达[1]。LIGHT是一个Ⅱ型穿膜蛋白，在人类和啮齿类动物中较为保守，小鼠和人LIGHT序列相似性达77%，小鼠全长LIGHT由239个氨基酸构成，分子量26.3 kDa[2]。LIGHT除可以以全长的形式定位于细胞表面外，还可以经蛋白酶切割，转变为可溶型蛋白游离于组织器官中。可溶型LIGHT由其C端182个氨基酸构成，分子量为20 kDa（本文中用LIGHTc表示）。

啮齿类动物中已经发现的LIGHT受体至少有两种，分别是LTβR和HVEM[3-5]。LIGHT结合其受体后，可以介导多种生物学过程，通过激活下游信号转导通路，引起各种生物学反应。最早研究表明LIGHT能够作为共刺激因子活化T细胞，且能促进T细胞分化和增殖[6-8]。此外，LIGHT还可以调控血小板聚集，促进间充质干细胞增殖，成肌细胞分化和骨骼肌再生以及介导哮喘等[9-13]。作为TNF超家族的一员，LIGHT也能够影响多种肿瘤的发生，如原发性脑癌、结肠癌等[14-15]。

本课题组前期的研究发现LIGHT还能够调控脂肪前体细胞的分化，脂肪前体细胞中过表达LIGHT能够明显抑制其向白色脂肪细胞和米黄色脂肪细胞的分化。脂肪细胞的增生和肥大是引起肥胖的最直接原因，因此进一步明确LIGHT调控脂肪前体细胞分化以及脂类代谢的机制，将为防治肥胖提供有力的理论支持[16]。

为便于研究LIGHT调控脂肪细胞分化及脂类代谢的机制，本研究拟通过基因克隆、大肠杆菌表达以及亲和纯化，對小鼠LIGHT胞外段进行异源表达纯化；而已有报道表明，人源的LIGHT胞外段能够抑制人结肠癌细胞的生长[17]。因此本实验中利用小鼠结肠癌细胞CMT93增殖实验检测所制备的可溶型小鼠LIGHT重组蛋白的活性。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 小鼠（C57BL/6）由本校实验动物中心养殖；小鼠脾脏、血液、肝脏、皮肤总cDNA由本实验室获得。大肠杆菌DH5α和BL21由本实验室保存；小鼠结肠癌细胞CMT93由本实验室保存。表达载体pGEX4T-1由本实验室保存。高保真DNA聚合酶Primer Star购自Takara公司；预混2×Taq Master Mix DNA聚合酶购自南京诺唯赞生物科技有限公司。限制性内切酶BamHI和NotI，T4连接酶购自Thermo Fisher。IPTG和GST标签蛋白纯化试剂盒购自碧云天。凝血酶购自生工。

1.2 方法

1.2.1 小鼠LIGHT胞外段编码序列扩增 由NCBI数据库获得小鼠LIGHT的完整cDNA序列（NM_019418），利用引物设计软件Primer 5.0分别获得LIGHT胞外段扩增引物：MusLIGHTc-F：5 CGCGGATCCAGACTGCATCAACGTCTTGGAGAC 3和MusLIGHTc-R：5 AAGGAAAAAAGCGGCCGCTCAGACCATGAAAGCTCCGAAATAG 3。分别以小鼠脾脏、血液、肝脏、皮肤总cDNA为模板，PCR扩增LIGHT胞外段编码序列（576 bp），产物经纯化后进行电泳分析。

1.2.2 表达质粒pGEX4T-1-LIGHTc构建 将纯化后的LIGHT胞外段PCR产物和原核表达载体pGEX4T-1用BamHI和NotI消化后再次纯化，纯化产物以1︰7摩尔比进行连接，连接产物通过热激法转化至大肠杆菌克隆菌株DH5α。挑取单克隆提取质粒，分别以ApaI和BamHI/NotI进行限制性酶切验证，酶切正确的质粒经测序验证无误后，命名为pGEX4T-1-LIGHTc，用于后续LIGHT胞外段表达纯化。

1.2.3 重组LIGHTc表达与纯化 通过热激法将表达质粒pGEX4T-1-LIGHTc转化至大肠杆菌表达菌株BL21，挑取单克隆经菌液PCR验证后，将阳性大肠杆菌BL21转接至新的LB培养基中，同时以pGEX4T-1作为阴性对照。过夜培养后将菌液按1︰100的比例接种到100 mL新鲜的LB培养基继续培养至OD600为0.5时加入终浓度0.5 mM的IPTG，20 ℃下诱导6～8 h，离心收集菌体。将菌体重悬于5 mL PBS缓冲液中，加入蛋白酶抑制剂后，于冰浴上进行超声处理。菌悬液由混浊变为清亮后进行离心，4 ℃，12 000 g，离心10 min，分别收集上清和沉淀用于后续SDS-PAGE检测。上清用GST标签蛋白纯化试剂盒（碧云天）进行纯化（按照操作手册进行）。重组蛋白不洗脱，结合重组蛋白的树脂重悬于1 mL含40 U凝血酶 PBS中，22 ℃，震荡孵育12 h。反应产物经4 ℃，500 g离心5 min收集上清，上清经超滤浓缩至200 μL，测定浓度，用于后续活性验证。

1.2.4 Western blot 菌体破碎上清液经蛋白浓度测定后，每孔上样总蛋白30 μg进行SDS-PAGE，转印至PVDF膜后用5%脱脂奶粉室温封闭2 h，用GST一抗4 ℃孵育过夜，洗涤后二抗孵育1 h再次洗涤后分别目的蛋白存在。

1.2.5 重组LIGHTc活性验证 小鼠结肠癌细胞CMT93经血球板计数后，调整细胞浓度至2×103个/mL，分为两组（分别加入终浓度1 μg/mL的BSA和重组LIGHTc），接种到含有新鲜DMEM（高糖）完全培养基的96孔板中，每组9孔（3个孔为一个平行组），分别于0、24、48 h通过CCK-8试剂盒测定细胞的相对数量（按照操作手册进行），判定重组LIGHTc是否具有抑制肿瘤细胞生长的活性。

1.3 统计学处理 采用Graph Pad Prism 5软件进行统计分析，计量资料采用（x±s）表示，两组间比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠LIGHT胞外段表达质粒构建 分别以小鼠脾脏、血液、肝脏和皮肤总cDNA为模板，PCR扩增小鼠LIGHT胞外段编码序列，见图1A。目的产物经纯化出除盐后，通过BamHI和NotI双酶切后连入原核表达载体pGEX4T-1，得到表达质粒pGEX4T-1-LIGHTc。pGEX4T-1-LIGHTc分别经BamHI/NotI和ApaI限制性内切酶消化验证，产生条带为549 bp/4 940 bp和2 241 bp/3 248 bp，见图1B，测序无误后用于后续实验。

2.2 小鼠LIGHT胞外段异源表达纯化及鉴定 测序无误LIGHT表达质粒转化至大肠杆菌表达菌株BL21后，菌液PCR筛选得到1号阳性转化子（图2A）。

IPTG诱导阳性转化子及阴性对照（图2B），菌体超声破碎后的上清中含有较大量的可溶型诱导表达蛋白（46 kDa）。Western blot检测上清中重组蛋白的存在（图2B），对照上清呈现GST阳性（26 kDa），重组蛋白表达菌株上清中检测到融合GST的46 kDa重组蛋白，表明上清中含有大量GST-LIGHTc蛋白。上清蛋白样品经GST亲和纯化柱结合及洗涤后，得到较纯的GST-LIGHTc重组蛋白（图2C）。

2.3 LIGHTc 活性检测 利用凝血酶对结合在亲和纯化树脂上的GST-LIGHTc进行消化（图3A），经凝血酶处理后得到了游离的可溶型LIGHT单体（20 kDa）。用终浓度1 μg/mL的LIGHTc处理CMT93细胞，分别在处理0、24、48 h时测定细胞的相对存活数。本实验中制备的LIGHTc能够明显抑制CMT93增殖，异源表达所制备的可溶型LIGHTc是具有生物学活性的，见图3B和表1。

3 讨论

LIGHT属于TNF超家族，在机体各组织器官中均有表达，并在成熟的T细胞和未成熟的树突状细胞中高表达，LIGHT参与多种生物学过程，如伤口愈合、纤维化、骨骼肌再生、干细胞分化等。明确LIGHT发挥作用的机制，对于阐明其所参与的生物学过程将具有重要的推动作用。本实验室前期研究表明LIGHT能够抑制脂肪前体细胞的分化，为进一步阐明其中的机制，对LIGHTc进行了大肠杆菌异源表达纯化。本研究通过大肠杆菌异源表达纯化制备了小鼠LIGHT胞外段，经凝血酶处理后得到20 kDa大小的游离的可溶型LIGHT单体，与其理论大小一致。结肠癌细胞增殖实验表明该蛋白能够一定程度上抑制结肠癌细胞的增殖，表明其具有生物学活性，可用于进一步实验中，研究LIGHT抑制脂肪前体细胞分化及生物学过程的分子机制，也将为研究LIGHT调控其他各种生物学过程的具体机制打下良好的材料基础。

LIGHT以膜蛋白形式存在時通常以三聚体的形式发挥作用[18]，单体的活性会有所下降，这可能是本实验中所制备LIGHTc蛋白对CMT93增殖抑制不强烈的原因。近期有研究表明，可以将目的蛋白融合人α1（I）胶原蛋白C-前导肽，利用前导肽的三聚体形式使目的蛋白形成三聚体，此法可以极大程度上增加重组蛋白活性[19-21]，如Liu等[20]通过将TRAIL融合人α1（I）胶原蛋白

C-前导肽，而将TRAIL制备成三聚体，相比于单体形式，三聚体抑制肿瘤形成的作用成几十倍的提升。但是，由于LIGHT是一个Ⅱ型穿膜蛋白，自然状态下其N端锚定于细胞膜上，C端位于胞外，因此采用Liu等[20]的方法，将LIGHTc的C端融合Trimer-tag后，由于空间结构的改变，其活性位点容易被覆盖，影响其活性。若利用人α1（I）胶原蛋白C-前导肽形成三聚体，将LIGHTc融合在前导肽的C端可能更能够保证LIGHTc活性的稳定，这种表达方法利用重组蛋白N端的α1（I）胶原蛋白C-前导肽形成三聚体，同时LIGHTc位于C端，可以最大程度模拟其自然状态下的构象，因此，推测活性会更加稳定。此外，也可通过生物素化标签的修饰，借助于链霉亲和素将目的蛋白制成四聚体，以增加其稳定性和活性。在LIGHTc的N端融合表达一个能够生物素化的标签，如AVI-tag等，通过体外生物素化处理，使能够生物素化的标签特异性生物素化，然后借助于链霉亲和素将重组蛋白聚合成四聚体。

LIGHT蛋白的异源表达将为后续研究LIGHT调控脂肪前体细胞分化的具体机制打下良好的材料基础。通过直接定量添加LIGHT重组蛋白，可从不同时间或分化阶段具体探究其对脂肪前体细胞分化的影响及作用机制，不仅对阐明脂肪细胞分化机制具有重要理论意义，而且对寻找预防和治疗肥胖的新方法及药物新靶点也具有长远的现实意义。此外，LIGHT重组蛋白也可以应用到模型中，为揭示受LIGHT调控各种生物学过程的具体机制提供有效的材料。

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