D18S51及其侧翼区3个SNP组成的SNP-STR在亲子鉴定中的应用

高泾尚 ，叶 懿，侯一平

（1.西藏自治区公安厅物证鉴定中心，西藏 拉萨 850000；2.四川大学华西基础医学与法医学院，四川 成都610041）

短串联重复序列（STR）多态信息含量高，分型快速，是目前法庭科学领域应用最广泛的一类遗传标记[1]。STR良好的多态性源于其在减数分裂过程中较高的突变率（1×10-3）[2]，也正因如此，日常检案中 STR突变的现象并不罕见。当被检父和孩子有1～2个STR基因座不符合孟德尔遗传规律时，通常会考虑突变，并通过增加检测其他高度多态性且遗传稳定的STR基因座，使累积父权指数（combined paternity index，CPI）达到认定亲权关系的标准[3]。但是，若被检父与可能的生父存在特殊的血缘关系（如父子关系、叔侄关系、同胞兄弟关系等），他们之间可能仅有个别STR基因座无相同的等位基因[4]，这种情形下，被检父和孩子之间存在仅有1～2个STR基因座不符合遗传规律的可能，在没有检测其他可疑亲属的情况下，得出认定的结论，会有误判的风险[5]。如果只能提供被检父的样品，则需要增加检测多态性更好而且稳定的遗传标记，才能有效地排除近亲属。

在选择多态性好且稳定的遗传标记方面，不少学者将处于一个单倍型区块的遗传标记STR、单核苷酸多态性（SNP）、插入/缺失（insertion/deletion，InDel）组合成新的遗传标记，例如SNP-SNP[6]、SNP-STR[7]和Multi-InDel[8]等单倍型，均显示比单个遗传标记有更好的多态性。同时，SNP、InDel突变率低（为10-9～10-8）[9]，更为稳定。本研究拟选取DNA联合索引系统（combined DNA index system，CODIS）中突变率较高的基因座D18S51[10]，与其侧翼区的3个SNP位点［rs8089331（C/G）、rs8094489（A/G）、rs7236090（T/C）］，组成SNP-STR单倍型，调查其在成都汉族人群的分布情况，并应用于二联体亲子鉴定案件。

1 材料与方法

1.1 实验对象

选取成都地区75名无亲缘关系的汉族个体，在签署知情同意书后，抽取肘静脉血2mL留检。

1.2 DNA提取

采用盐析法[11]提取核基因组DNA。

1.3 STR分型

D18S51基因座引物信息来自STRBase数据库，反应体系和反应条件参照文献[12]，在9700型PCR仪（美国AB公司）上进行扩增，PCR产物进行6%聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染，以实验室自制的等位基因分型标准物进行分型。

1.4 SNP的筛选和分型

在美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）数据库查看基因座D18S51侧翼序列信息，选取侧翼区最小等位基因频率＞0.1的SNP位点。选择的3个SNP位点（rs8089331、rs8094489 和 rs7236090）与 D18S51 的相对位置如图1所示。

图1 D18S51及其侧翼区3个SNP的相对位置

通过等位基因特异性聚合酶链反应（allele specific polymerase chain reaction，ASPCR）方法[13]获得 SNP分型。根据NCBI数据库获取的SNP位点序列信息，使用Oligo 6软件设计引物，在正向引物3′端引入错配碱基，通用反向引物为5′-ATTCTACCAGCAACAA CACAAATAAAC-3′，扩增采用 LATaq®DNA聚合酶（日本TaKaRa公司），正向引物序列、具体反应体系及扩增条件如表1（扩增条件均为预变性95℃ 4min和最后延伸72℃ 10 min，表中略）。PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，在紫外线灯下观察荧光带，通过条带的有无进行分型。为防止非特异性扩增导致的分型错误，每个样品同时通过限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP） 技术验证分型结果。

表1 ASPCR正向引物序列、反应体系、扩增条件及产物大小

1.5 SNP-STR单倍型分型

参照本课题组报道的巢式PCR技术[7]：在ASPCR扩增后，选取距STR最远的SNP杂合子的PCR产物（如rs8089331为纯合子，选择rs8094489杂合子；如rs8089331和rs8094489为纯合子，选择rs7236090杂合子），稀释107倍作为扩增模板，重复1.4节获得单链的SNP单倍型，重复1.3节的步骤获得单链的STR分型，拼接后即可获得SNP-STR单倍型。

如果3个SNP均为纯合子，则直接获得单倍型。

1.6 单倍型统计

采用直接计数法计算单倍型的个数，根据NEI[14]的公式计算单倍型多样性。

1.7 案例应用

案例1：当事人怀疑孩子为妻子与自己父亲所生，故委托鉴定自己是否为孩子的生物学父亲，采用AmpFℓSTR®IdentifilerTM试剂盒（美国AB公司）复合扩增后发现FGA、D18S51两个基因座不符合遗传规律，其中被检父基因型为 FGA（22，24）、D18S51（16，16），孩子为 FGA（23，26）、D18S51（13，17）。

案例2：二联体亲子鉴定案例，采用AmpFℓSTR®IdentifilerTM试剂盒复合扩增后发现D18S51基因座不符合遗传规律，被检父基因型为 D18S51（12，20），孩子为 D18S51（14，18），加做 STRtyper-10G 试剂盒（珠海科登生物技术有限公司）及本实验室自制的miniYSTR试剂盒[15]进行验证。

两个案例均通过本文描述的方法获得SNP-STR单倍型，如果孩子可以从被检父处获得SNP单倍型，两步突变PI值[16]的计算公式为：

公式中STR位点的平均突变率（μ）参照LI等[10]的报道，D18S51位点的μ值为0.0025。

2 结 果

通过本研究建立的方法，成功获得75名个体的150个SNP-STR单倍型。仅检测3个SNP时，单倍型只有7种，当引入STR组成SNP-STR后，单倍型增加到43种。75名个体的单倍型个数分布情况见表2，单倍型多样性为0.9486。

表2 D18S51基因座与其侧翼区的3个SNP组成的SNP-STR单倍型个数统计

案例1中，被检父SNP-STR单倍型为CAC-16、CAC-16，孩子为 GGC-13、GAT-17，被检父和孩子无相同的SNP单倍型和STR分型，两个SNP和两个STR同时发生突变的概率极低，排除亲权关系。

案例2中，被检父SNP-STR单倍型为CAC-12、CAT-20，孩子为 CAT-14、CAT-18，被检父和孩子有一个相同的SNP单倍型CAT。引入SNP-STR后，PI值为0.001339286。联合AmpFℓSTR®IdentifilerTM和STRtyper-10G两个试剂盒共24个STR基因座检测结果，CPI为1 685 160.35，检测系统的二联体非父排除率大于0.999 999[17]，且6个Y-STR基因座分型结果均符合父系遗传规律，支持父权关系的存在。

3 讨 论

STR基因座，特别是CODIS的13个STR基因座，包含在很多商品化试剂盒中，已做了大量的群体多态性调查，建立了相关的数据库，为个体识别和亲子鉴定提供了数据基础。在现有的STR数据基础上，引入SNP单倍型“尾巴”，组成SNP-STR，可以提高遗传标记的信息量。但应注意选择的SNP应和STR在同一个单倍型区块，不能横跨突变热点。单倍型一般通过系谱推断、统计学计算或者实验法获得，对于单个个体的单倍型，只能通过实验法[18]。本研究是通过ASPCR方法获取单拷贝片段，再对单拷贝片段的遗传标记进行分型，最后将分型结果顺序排列组成单倍型。但是，ASPCR方法会出现假阳性的结果，可以通过升高退火温度、降低Mg2+浓度、减少循环次数等方法提高PCR反应的特异性。同时，本研究还通过RFLP方法来确保SNP分型的正确性。但是，整个方法过于繁琐，且本次研究样品量偏少，在下一步的研究中会增加样本量。随着三代测序平台的出现，例如单分子荧光或纳米孔[19]，可以简化获得常染色体单倍型的过程，在未来可能成为高通量且能得到较长单倍型片段的主流方法。

在成都汉族人群中，CAT、CAC是两种主要的SNP单倍型，在150个单倍型中占了73.3%。对于不同的D18S51等位基因，其尾随的SNP单倍型分布也各不一样：等位基因为13、14时，CAT占多数；等位基因为15、16时，CAC 占多数。

单倍型区块中SNP个数越多，单倍型种类越多，CSF1PO侧翼区的5个SNP共发现了26种单倍型[7]。由于SNP突变率极低，多个SNP同时突变的情况接近于零。因此，案例1中孩子的SNP单倍型无法从被检父处找到来源，可以排除被检父为其生物学父亲的可能。如果能找到SNP单倍型来源，可以直接观察孩子的STR突变来自父亲的哪一条染色体。案件2中被检父和孩子有一个相同的SNP单倍型CAT，所以孩子D18S51等位基因18是由被检父的等位基因20滑脱了2个核心序列后产生。将SNP-STR引入PI的计算，简化了公式，同时降低了误判的可能性，较STR可能会有更高的PI值，使CPI达到认定亲权关系的标准[7]。

相对于STR，SNP-STR能以较少的数量达到STR同样的效能，而且可以在复杂亲缘关系鉴定中发挥重要的作用，应引起法医学者的重视。

[1]侯一平.法医常染色体STR分型[J].中国法医学杂志，2001，16（1）：1-5.

[2]刘素娟，李成涛，陈文静，等.常染色体STR突变率的研究[J].中山大学学报（医学科学版），2013，34（3）：326-330.

[3]中华人民共和国司法部司法鉴定管理局.亲权鉴定技术规范：SF/Z JD0105001—2016[S].2016.

[4]ZAKEN N，MOTRO U，BERDUGO R，et al.Can brothers share the same STR profile?[J].Forensic Sci Int Genet，2013，7（5）：494-498.

[5]陈芳，陈俭，徐恩萍，等.争议父与生父存在近亲血缘关系的亲权鉴定[J].法医学杂志，2015，31（2）：150-151，155.

[6]GE J， BUDOWLE B， PLANZ J V， et al.Haplotype block：a new type of forensic DNA markers[J].Int J Legal Med，2010，124（5）：353-361.

[7]YE Y， LUO H， LIAO L， et al.A case study of SNPSTR efficiency in paternity testing with locus incompatibility[J].Forensic Sci Int Genet，2014，9：72-75.

[8]HUANG J，LUO H，WEI W，et al.A novel method for the analysis of 20 multi-Indel polymorphisms and its forensic application[J].Electrophoresis，2014，35（4）：487-493.

[9]NACHMAN M W，CROWELL S L.Estimate of the mutation rate per nucleotide in humans[J].Genetics，2000，156（1）：297-304.

[10]LI H X， TONG D Y， LU H L， et al.Mutation analysis of 24 autosomal STR loci using in paternity testing[J].Forensic Science International：Genetics Supplement Series，2011，3（1）：e159-e160.

[11]MILLER S A，DYKES D D，POLESKY H F.A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells[J].Nucleic Acids Res，1988，16（3）：1215.

[12]李怡，司艳梅，杨艳丽，等.河南汉族群体D18S51基因座的遗传多态性研究[J].中国优生与遗传杂志，2002，10（5）：10-11，17.

[13]HAYASHI K，HASHIMOTO N，DAIGEN M，et al.Development of PCR-based SNP markers for rice blast resistance genes at the Piz locus[J].Theor Appl Genet，2004，108（7）：1212-1220.

[14]NEI M.Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals[J].Genetics，1978，89（3）：583-590.

[15]ZHANG D，ZHANG D，WU W，et al.Haplotypes of six miniY-STR loci in the Han population from Sichuan province and the Zhuang population in Guangxi Zhuang autonomous region[J].Forensic Sci Int Genet，2009，3（2）：e49-e51.

[16]Mutations in Paternity[Z/OL].[2017-02-10].http://dnaview.com/mudisc.htm.

[17]HOU J Y，TANG H，LIU Y C，et al.How many markers are enough for motherless cases of parentage testing[J].Forensic Science International：Genetics Supplement Series，2008，1（1）：649-651.

[18]叶懿，罗海玻，侯一平.单倍型的分析及其法医学应用[J].法医学杂志，2009，25（2）：133-137.

[19]SCHNEIDER G F，KOWALCZYK S W，CALADO V E，et al.DNA translocation through graphene nanopores[J].Nano Lett，2010，10（8）：3163-3167.