三种常见致男性不育疾病中精子DNA碎片检测的意义

李真法，陆文昊，杨欢利，蔡娇娇，陈辉波

（浙江省台州医院，浙江 临海317016）

近年来，不孕不育患者的人数日趋增加，男性不育是亟需解决的生殖难题。有研究证实，常见疾病在不同程度上都会对精子DNA产生损伤[1]，现将最常见的三种对DNA有损伤的疾病 （精索静脉曲张、乙肝病毒感染、生殖系统感染）的男性不育患者与正常生育能力的健康男性进行比较，探讨不育症患者的不育原因，报道如下。

1 对象与方法

1.1对象 选择2012年3月～2016年9月在本院生殖中心就诊的男性不育患者。纳入标准：婚后正常性生活1年以上未育，无外伤及遗传性疾病家族史，无性功能障碍病史，体检未发现有明显睾丸、附睾及输精管异常及其他系统性疾病。共入选356例，分为3组：精索静脉曲张组120例，年龄（31.1±2.7）岁；乙肝病毒组 101 例，年龄（29.3±2.0）岁；生殖系统感染组 135例，年龄（28.2±3.2）岁，另外选取正常生育能力组 78例，年龄（30.1±2.9）岁。

1.2研究方法

1.2.1标本采集及分析 禁欲2～7天后手淫取精液置于干燥无菌的取精杯中，置37℃水浴箱内液化30分钟。使用WLJY-9000全自动精液质量分析系统，按照第5版《WHO人类精液检查与处理实验室手册》采用计算机辅助精液分析系统行精液质量分析，记录精液体积、精子浓度、精子前向运动率（PR）、精子非前向运动率（NP）及精子不动率（IM）。

1.2.2DNA碎片检测 试剂盒购自深圳华康生物医学工程有限公司，所有步骤参考试剂说明书进行，步骤如下：（1）取精液待检样本，用PBS调整浓度 5～10×106/mL；（2）把调整好的精子悬液与琼脂糖混合并铺于预冷的载玻片上，4℃冰箱放置5分钟；（3）载玻片放至0.6%盐酸7分钟，然后放至样品萃取液25分钟；（4）把玻片置入蒸馏水5分钟，然后分别置入70%、90%、100%乙醇中2分钟，取出晾干；（5）染色：加瑞氏-吉姆萨染液10滴染色3分钟，然后再加0.8%氯化钠10滴与瑞氏-吉姆萨染液混匀，染色15分钟，用纯净水洗涤玻片，封片剂封片。

1.2.3结果判定 （1）大晕环:晕环宽度≥精子头部核较小直径；（2）中晕环：晕环宽度≥精子头部核较小直径的 1/3～1；（3）小晕环：晕环宽度＜精子头部核较小直径1/3；（4）无晕环和退化：精子观察不到晕环，且精子核区染色较浅。大晕环和中晕环表示精子核DNA完整，小晕环、无晕环和退化表示精子核DNA损伤。精子DNA碎片化指数 （DFI）=〔（小晕环精子+无晕环精子+退化精子）/计数精子总数〕×100%，精子 DFI＞10%为异常。

1.3统计学处理 采用SPSS13.0统计软件对数据进行分析，数据采用（±s）表示，组间比较采用t检验。

2 结果

2.1精液常规检测 精液体积、精子浓度及非前向运动（NP）的结果，四组之间比较差异无统计学意义（均P＞0.05）；精索静脉曲张组、乙肝病毒组与生殖系统感染组三组之间，精子前向运动率（PR）及不动率（IM）比较差异无统计学意义（均P＞0.05），精索静脉曲张组、乙肝病毒组、生殖系统感染组分别与正常生育能力组比较，PR%及IM%比较差异具有统计学意义（均P＜0.05）。详见表1。

2.2精子DFI 精索静脉曲张组、乙肝病毒组分别与生殖系统感染组比较差异有统计学意义 （P＜0.05），精索静脉曲张组与乙肝病毒组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。精索静脉曲张组、乙肝病毒组和生殖系统感染组分别与正常生育能力组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。详见表1。

表1 四组精液的常规参数和精子DFI比较（±s）

表1 四组精液的常规参数和精子DFI比较（±s）

与正常生育能力组比较*P＜0.05；与生殖系统感染组比较△P＜0.05

组别 n 体积（mL） 浓度（×106/mL） PR（%） NP（%） IM（%） 精子DFI(%)精索静脉曲张组 120 3.12±1.11 68.34±28.98 27.87±11.43* 18.45±6.67 53.68±8.65* 30.23±12.34*△乙肝病毒组 101 3.21±1.32 70.65±29.54 25.76±10.63* 19.33±5.87 54.91±7.74* 29.54±11.45*△生殖系统感染组 135 3.19±1.23 73.98±31.76 28.08±9.42* 21.54±6.66 50.38±8.02* 20.87±9.76*正常生育能力组 78 3.42±1.54 77.34±27.87 45.23±6.92 17.78±5.86 36.99±5.97 13.54±5.64

3 讨论

人类精子染色质的结构由DNA双链和鱼精蛋白结合形成，易受到疾病和环境等因素影响[2]，精子DNA的损伤会导致男性的生育力下降，与男性不育有着直接关系[3]。本研究中，精索静脉曲张组和乙肝病毒组比生殖系统感染组的精子DFI均高，不育症组（精索静脉曲张组、乙肝病毒组和生殖系统感染组）比有正常生育能力组的精子DFI高，说明精索静脉曲张（VC）、乙肝病毒感染、生殖系统感染对精子DNA碎片有很大影响，特别是精索静脉曲张和乙肝病毒感染。

VC是男性常见生殖系统疾病，占男性不育症成因的40%左右[4]，在三种疾病中所占比例最高，是导致男性不育的主要原因之一。VC是指精索内蔓状静脉丛的异常伸长、扩张和迂曲。当发生VC时，阴囊温度增高，从而增多氧自由基等有害物质，造成附睾微环境障碍，影响精子生成[5]。本组中，VC患者精子前向运动率（PR）与正常生育能力组相比较低（P＜0.05），说明VC患者精子活力受到损伤。有研究认为，VC患者的精液可能缺乏抗氧化机制，大量的过氧化物攻击精子，致使细胞凋亡，从而影响精子活力[6]。VC患者精子DFI较正常生育组高（P＜0.01），说明VC对精子DFI的影响很大。潘连军等[7]研究也表明，VC中精子质膜磷脂酰丝氨酸（PS）外翻、线粒体功能障碍及各种生化指标异常是精子DNA损伤的主要因素之一。故VC患者应尽早行精索静脉高位结扎，以改善精子生存环境，提升精子质量[8]。

生殖系统感染在导致男性不育的诸多因素中约占4%～10%[9]，仅次于精索静脉曲张。Collodel等[10]显示，男性生殖系统感染可降低精子活动力，精子DFI指数升高，导致感染性男性不育。生殖系统感染患者的精液中，白细胞水平＞1.0×106/mL，与其分泌的弹性蛋白酶升高导致精子膜的损伤，从而破坏精子DNA完整性有关[11]。本文生殖系统感染组精子前向运动率远低于正常生育能力组（P＜0.05），精子DFI高于正常生育能力组（P＜0.05），说明生殖系统感染对精子活力有明显的影响。

乙肝病毒不仅具有嗜肝性，还可以感染男性生殖器官。HBV会影响男性精子染色体的结构，破坏其稳定性，导致精子DNA基因发生不可逆的变异，影响精卵结合[6]。杨旭等[12]研究指出，HBV阳性患者精子浓度、活动精子总数及正常形态精子数均低于阴性者，原因可能是HBV在睾丸上复制时，DNA与精子染色体整合，引起精子DNA损伤从而影响精子质量。本研究中乙肝病毒感染组PR较正常生育能力组低（P＜0.05），乙肝病毒感染组精子DFI较正常生育能力组高（P＜0.05）。 有研究指出[13-14]，男性不育症中同时伴有HBV感染者的精子DFI显著高于无HBV感染者，说明感染HBV可能会加重男性不育患者的精子DNA损伤。

综上所述，精子DNA碎片化指数能较好地评估精液质量和男性生育能力，在男性不育中进行检测有着重要的意义。

[1] De Bantel，Feith J，Poirot C，et al.Simultaneous vitality and DNA－fragmentation measurement in spermatozoa of smokers and non-smokers.Cytometry.Part B，Clinical Cytometry，2015，88（2）:120

[2] Bungum M.Sperm DNA integrity assessment:a new tool in diagnosis and treatment of fertility.Obstet Gynecol Int，2012:531

[3] Irvine DS，Twigg JP，Gordon EL，et al.DNA integrity in human spermatozoa:relationshipswith semen quality.Androl，2000，21（1）:33

[4] 郭应禄，胡礼泉.男科学.北京:人民卫生出版社，2005:1623

[5] Wu J，Cui Y，Chen JW，et al.The prescription of “Tong jing ling”on DFI caused by varicocele in male inferlility.Journal of Zhe jiang Chinese Medicine University，2016，40（5）:356

[6] 吴阶平.吴阶平泌尿外科学.济南:山东科学技术出版社，2005:1951

[7] 潘连军，高佃军.精索静脉曲张与生精细胞凋亡.国外医学:计划生育/生殖健康分册， 2016，25（1）:9

[8] 王英俊，张唯力，李大文.精索静脉高位结扎术改善弱精子症患者精子DNA完整率的临床研究.中南大学学报（医学版），2012，37（12）:1228

[9] Rusz A，Pilatz A，Wagenlehner F，et al.Influence of urogenital infections and inflammation on semen quality and male fertility.World J Urol，2012，30（1）:23

[10]Collodel G，Moretti E，Campagna MS，et al.Infection by CagA positive helicobacter pylori strains may contribute to alter the sperm quality of men with fertility disorders and increase the systemiclevels of TNF-α.Dig Dis Sci，2010，55（1）:94

[11]Kopa Z，Wenzel J，Papp GK，et al.Role of granulocyte elastase and interleukin-6 in the diagnosis of male genital tract inflammation.Andrologia，2005，37（5）:188

[12]杨旭，李庆兴，林佳，等.血清HBV-DNA水平与精液参数及体外受精-胚胎移植结局的相关性分析.中华流行病学杂志，2014，35（12）:1411

[13]Kennedy C，Ahlering P，Rodriguez H，et al.Sperm chromatin structure correlates with spontaneous abortion and multiple pregnancy rates in assisted reproduction.Reproductive biomedicine online，2011，22（3）:272

[14]梅顺利，兰孟东，刘平.乙型肝炎病毒携带者精子中HBVDNA的检测及意义.中国优生与遗传杂志，2009，17（3）:117，128