孤啡肽受体的功能可塑性决定其激动剂的镇痛性质

杨 光,韩 毅,杨建新*

(1山西医科大学麻醉学系,太原 030001;2山西医科大学第二医院麻醉科;*通讯作者,E-mail:yangjxin66@163.com)

1994年,就在μ、δ、κ阿片肽受体被克隆不久以后,一些研究团队确定了一种与阿片受体同源性较高的G蛋白偶联受体[1],不过这种G蛋白偶联受体对阿片类配体的亲和力却很低,因此,这种受体被暂时命名为阿片受体1(ORL1)。1年后,两个研究团队各自确定了阿片受体1的配体,它是一种十七肽物质[2],被命名为孤啡肽(NOP)。后国际药理学联合会将其纳入阿片肽受体家族的一个子范畴。本文就孤啡肽受体的结构组成、孤啡肽前体及信号转导、孤啡肽受体与N型钙离子通道的相互作用、孤啡肽受体的分布和组织功能等方面进行系统的阐述。

1 孤啡肽受体的结构

对人和大鼠的cDNA文库筛选发现,两者的孤啡肽受体氨基酸数目十分接近,人的为370个氨基酸残基,分子量约40 690[3];大鼠的为367,分子量为40 529[4]。两者之间的同源性高达92%。它们均具有7个疏水区域,对应于7个跨膜区域。编码人的孤啡肽受体的cDNA约为3.2-3.3 kb,编码大鼠孤啡肽受体的cDNA约为3.1 kb。孤啡肽受体属G蛋白偶联的受体,正如阿片受体及多数与G蛋白偶联的受体那样,人的孤啡肽受体也存在一些翻译后修饰位点,如在N-端有3个门冬酰胺残基与糖基化有关;在第一和第二胞外环上各有一个半胱氨酸残基,与受体的稳定性有关[3]。

人的孤啡肽受体与以往克隆出的阿片受体在结构上有许多类似之处,就其同源性而言,在所有跨膜区内为67%,在第二和第三跨膜区内可大于82%,第七跨膜区内为80%,在胞浆环内为75%,但在N-端、第二和第三胞外环以及C-端则明显不同。人的孤啡肽受体在第二和第三个跨膜区内各含一个门冬氨酸残基,分别是结合激动剂和受体结构调节的关键部位【5】,这为孤啡肽受体的特殊作用提供了结构基础。

2 孤啡肽前体及其受体的信号转导

孤啡肽是由一种名为“前孤啡肽原”的大型前体物质产生的,它由176个氨基酸组成,位于人类染色体8p21,可编码两个额外的肽类物质孤啡肽-Ⅱ和痛稳素[6]。由于二者精确的细胞作用靶点仍未知,所以对于孤啡肽-Ⅱ和痛稳素的作用靶点一直是人们激烈讨论的主题。孤啡肽-Ⅱ有着镇痛作用,同时可增加啮齿动物的自发性活动[7]。而关于痛稳素,通常它可以逆转由孤啡肽介导的谷氨酸释放作用,从而影响某些递质的释放,同时还会损伤大脑的学习和记忆功能。现已明确,痛稳素不与孤啡肽受体相互作用,但其细胞的精确作用靶点仍然未知。

与阿片受体相似,孤啡肽受体也可以抑制腺苷酸环化酶,激活内向整流钾通道,通过耦合G蛋白关闭钙通道。然而,与阿片受体相反,孤啡肽受体已经被Klukovits等[8]证实还可以结合对百日咳毒素非敏感型的G蛋白如Gz、G16、Gs。

Han等[9]的研究发现,活化的孤啡肽受体可触发细胞内各种信号转导事件,包括腺苷酸环化酶活性的调节和PKC,PLA2,PLC,ERK1/2,p38,MAPK,JNK,以及NF-κB的激活。

由孤啡肽受体介导的抑制性神经递质的释放是它调节多种生物功能的基础。孤啡肽受体活化后通过突触前抑制、调节电压门控钙通道以及内向整流钾通道,降低了神经元的兴奋性同时减少了包括去甲肾上腺素、多巴胺、5-羟色胺、乙酰胆碱和谷氨酸等[10]神经递质的释放。

综上可以看出,孤啡肽受体的信号转导是一个精细而复杂的生物学过程,其具体机制还有待于进一研究。

3 孤啡肽受体的分布及其组织功能

孤啡肽受体及它的配体孤啡肽广泛表达于啮齿动物、非人灵长类动物以及人类的中枢神经系统、外周神经系统、免疫系统以及许多外周器官。尤其是孤啡肽受体在脊髓背根神经节、背角和腹角,大脑的前脑,包括皮质区、嗅觉区、丘脑,以及各种边缘结构,如海马、中隔的终纹床核、杏仁复合体,还有在下丘脑中一些参与情绪加工的核团中表达。孤啡肽受体同时也位于大脑5-羟色胺能、去甲肾上腺素能以及多巴胺能的核团中,比如中缝核、蓝斑、孤束核、腹侧被盖区和黑质等。同时,Mollereau等[11]的研究也发现了有关孤啡肽及其受体在人类中枢神经系统中的表达模式。

研究发现孤啡肽受体还在其他外周组织中表达,即在啮齿动物以及人类淋巴细胞中、兔眼视网膜中、大鼠心脏内都有表达[12]。正是由于孤啡肽受体的广泛分布,所以孤啡肽可以调节许多生理反应,包括紧张、焦虑、食物摄入、学习记忆、运动等活动,以及呼吸系统功能、免疫系统功能、泌尿系统功能、心血管功能和肾功能等。孤啡肽受体还能够识别节前或节后的交感和副交感神经纤维,支配血管和心脏,参与孤啡肽的心血管效应,并可能在原发性高血压、心肌缺血及脑缺血的病理生理学中发挥一定作用[13,14]。

4 孤啡肽受体与N型钙离子通道的相互作用

与G蛋白偶联的孤啡肽受体的激活已经被证实可以阻止Cav2.2 N型钙离子通道的开放,从而减轻疼痛[15]。Stafford等[16]的最新研究显示孤啡肽受体和N型钙离子通道激活后可以形成一种信号复合物,使离子通道内化成囊泡间隔,有效地阻止钙离子内流入细胞,从而延长激活持续时间。但最近的一项对孤啡肽敏感型大鼠亚群的脊髓背根神经节的研究发现,虽然给予孤啡肽后可抑制脊髓背角传入神经元的兴奋性突触后电位,但它并没有使得胞体或者背根神经节的神经末梢中N型钙离子通道发生内化现象,也就无法阻止钙离子内流入细胞,减轻疼痛[17]。其他研究揭示了即使缺乏孤啡肽,其受体仍然可以抑制N型钙离子通道。因此,虽然人们在孤啡肽受体系统可抑制N型钙离子通道的能力上达成一致,但是有关具体是哪种方式控制钙离子通道的活动及其调控的精确机制仍在探索中。

5 孤啡肽受体与μ-阿片肽受体(MOP)的相互作用

在啮齿动物中,人们已经用原位杂交技术、免疫组化法、PCR法在基因转录和蛋白质翻译水平上对孤啡肽受体进行了大量的研究。Rojewska等[18]通过免疫组化研究表明NOP受体和MOP受体分别在各自区域参与痛觉信号的处理。Gunduz等[19]运用膜片钳技术研究孤啡肽和吗啡在抑制大鼠脊髓背根神经节细胞的N型钙离子通道开放的实验中证明了NOP受体和MOP受体在同一神经元上存在功能上的协同作用。同时在人类神经母细胞瘤细胞中也发现了NOP、MOP受体细胞共同表达以及二者的异源二聚化现象[20,21]。在神经性疼痛大鼠模型中,脊髓注射MOP、δ-阿片肽(DOP)、κ-阿片肽(KOP)受体激动剂可导致大鼠发生痛觉过敏现象,而脑室注射孤啡肽也会使大鼠痛觉过敏[22]。另外对孤啡肽基因敲除小鼠在急性热损伤时的研究和糖尿病小鼠在热痛觉过敏条件下的研究也阐明NOP与阿片受体之间存在复杂的相互作用[23],在此不再一一赘述。综上所述,MOP以及其他阿片受体的确可与NOP受体以某种复杂的方式相互作用,表明在一定的实验条件下MOP或许也可协助增加NOP受体介导的镇痛效应。

6 孤啡肽受体及阿片受体系统在痛觉调控中的相互作用

侧脑室注射孤啡肽不仅引起痛敏作用,还能对抗内源性或外源性阿片肽的镇痛,脑室注射孤啡肽对于μ、κ及σ阿片受体所介导的镇痛都有拮抗作用[24]。由于孤啡肽本身并不和其他的阿片受体相结合,推测孤啡肽的这种对抗作用是由于孤啡肽与其受体结合后通过一定的神经通路而引起的功能对抗。而Pan等[25]的研究结果提示孤啡肽在延髓头端腹内侧区(RAM)神经元中的作用,这从另一个方面解释了孤啡肽的抗阿片作用。总体而言,在RAM的神经元中存在这两种细胞:“初级细胞”和“次级细胞”,孤啡肽对这两种细胞起的都是抑制的作用,在阿片物质和孤啡肽同时作用于RAM的神经元时,这种抑制作用调节了两种细胞之间的平衡状态,也因此产生了不同的效应。

脊髓水平给予大剂量的孤啡肽可产生明显的镇痛作用[26],也有报道表明鞘内注射孤啡肽可促进和协同吗啡所产生的镇痛[27];而Yu等[28]则报道5-10 nmol的孤啡肽在脊髓水平上引起的镇痛作用不仅可被孤啡肽受体专一性拮抗剂[Nphe1]NC(1-13)NH2所拮抗,也能被μ和σ受体拮抗剂所拮抗,表明此镇痛作用有内源性阿片系统参与其中。

孤啡肽受体与阿片受体之间具有50%左右的同源性。而在痛觉调节的生理过程中,孤啡肽的作用同样与阿片肽的作用紧密相连。在脊髓和脊髓以上水平,孤啡肽与阿片系统之间的作用并不相同,说明了其作用于机体痛觉调节过程的复杂性。值得注意的是,孤啡肽受体的专一性拮抗剂[Nphe1]NC(1-13)NH2不仅可以减轻机体对吗啡的耐受作用,本身还具有不产生耐受的镇痛作用[28],显示其可成为新药的良好前景。

7 孤啡肽受体的应用前景

虽然孤啡肽受体与阿片受体有着很高的序列相似度,但有研究表明二者在内源性配体选择上、信号转导、磷酸化作用、脱敏现象等方面有着显著不同[29]。孤啡肽受体在外周功能表达与调控以及其在痛觉传导通路中的中心位置展示了其在神经性和炎性疼痛下确实有着高度的可塑性以及应用前景。在啮齿动物中,全身给予孤啡肽受体激动剂可以在神经性与炎性疼痛的动物模型上产生抗变态反应。但是,他们大多在应对急性疼痛上是无效的,反而还会诱发严重的运动系统副作用[30]。与之相反的是,非人灵长类动物全身给予孤啡肽受体激动剂后却表现出有效的镇痛作用同时鲜有运动系统的副作用。此外,在非人灵长类动物中,同时激活孤啡肽受体与μ阿片受体可以协同产生镇痛作用[31]。虽然孤啡肽对各个物种镇痛的效力以及产生耐受性的机制目前还不是很明确,但随着调查研究的深入,相信这些谜团终将拨云见日。因此,孤啡肽受体激动剂依然有很大可能在临床中成为治疗急慢性疼痛的有效镇痛剂。

8 结论

虽然孤啡肽受体系统与阿片受体系统具有很高的同源性,但二者在分子、细胞和行为水平上都存在明显的差异。孤啡肽受体系统在受到慢性疼痛刺激时可与阿片受体系统相互作用,在此条件下产生强大的镇痛作用,全身给予孤啡肽受体激动剂可以在非人灵长类动物中发挥出强有效的镇痛作用,而在啮齿类动物疼痛模型中却缺乏这种镇痛作用。在一定疼痛状态下或与MOP受体相互作用的条件下,孤啡肽受体系统展现出独特的可塑性,将为阿片类药物研究领域提供新的研究方向。虽然我们对啮齿动物孤啡肽受体的理解仍然有许多现实的差距,但我们对孤啡肽受体激动剂在非人灵长类动物上的镇痛效果和耐受性的研究将会更引人注目。我们希望通过探索经脊髓不同节段注射孤啡肽受体激动剂对非人灵长类动物镇痛效果的影响,以及寻找在炎性疼痛时孤啡肽受体发生功能敏化的调节机制等,尝试建立起一个完善的通路,来帮助我们判断在各类疼痛条件下它们是否具有作为新型镇痛药的潜力。关于孤啡肽受体新的生理功能的发现及相关机制的研究仍是未来孤啡肽受体研究的重要方向,这将是孤啡肽受体激动剂从实验探索阶段成功过渡到临床使用阶段的关键一步。

参考文献：

[1] Alexander SPH,Benson HE,Faccenda E,etal.The concise guide to pharmacology 2013/14:Gprotein-coupled receptors[J].Br J Pharmacol,2013,170(8):1459-1581.

[2] Agostini S,Petrella C.The endogenous nociceptin/orphanin FQ-NOP receptor system as a potential therapeutic target for intestinal disorders[J].Neurogastroenterol Motil,2014,26(11):1519-1526.

[3] Toll L,Bruchas MR,Calo′G,etal.Nociceptin/Orphanin FQ receptor structure, signaling, ligands, functions, and interactions with opioid systems[J].Pharmacol,2016,68(2):419-457.

[4] Ciccocioppo R,de Guglielmo G,Hansson AC,etal.Restraint stress alters nociceptin/orphanin FQ and CRF systems in the rat central amygdala: significance for anxiety-like behaviors[J].J Neurosci,2014,34(2):363-372.

[5] Hayashi S,Ohashi K,Mihara S,etal.Discovery of small-molecule nonpeptide antagonists of nociceptin/orphanin FQ receptor: The studies of design, synthesis, and structure-activity relationships for (4-arylpiperidine substituted-methyl)-[bicyclic (hetero)cycloalkanobenzene] derivatives[J].Eur J Med Chem,2016,114:345-364.

[6] Liu EH,Li C,Govindasamy M,etal.Elevated prepronociceptin, nociceptin/orphanin FQ and nocistatin concentrations in rat chronic constriction nerve injury and diabetic neuropathic pain models[J].Neurosci Lett,2012,506(1):104-106.

[7] Rossi GC,Pellegrino M,Shane R,etal.Characterization of rat prepro-orphanin FQ/nociceptin: nociceptive processing in supraspinal sites[J].J Pharmacol Exp Ther,2002,300(1):257-264.

[8] Klukovits A,Tekes K,Gunduz CO,etal.Nociceptin inhibits uterine contractions in term-pregnant rats by signaling through multiple pathways[J].Biol Reprod,2010,83(1):36-41.

[9] Han Y,Guo Z,Wang LL,etal.Antagonism of endogenous nociceptin/orphanin FQ inhibits infarction-associated ventricular arrhythmias via PKC-dependent mechanism in rats[J].Br J Pharmacol,2013,170(3):614-623.

[10] Kallupi M,Scuppa G,Guglielmo G,etal.Genetic deletion of the nociceptin/orphanin FQ receptor in the rat confers resilience to the development of drug addiction[J].Neuropsychopharmacology,2017,42(3):695-706.

[11] Mollereau C,Mouledous L.Tissue distribution of the opioid receptor-like (ORL1) receptor[J].Peptides,2000,21(7):907-917.

[12] 姚太平,郭政.冠脉结扎大鼠小肠孤啡肽表达的变化[J].山西医科大学学报,2011,42(12):950-953.

[13] Brookes ZL,Stedman EN,Brown NJ,etal. The nociceptin/orphanin FQ receptor antagonist UFP-101 reduces microvascular inflammation to lipopolysaccharide in vivo[J].PLoS One,2013,8(9):e74943.

[14] 郭薇,刘水平,陈玉川.阿片受体及其内源性配体与心律失常相关研究[J].山西医科大学学报,2001,32(Supp1):69-71.

[15] 张林忠.孤啡肽对大鼠左心室功能的影响及其机制研究[D].太原:山西医科大学,2009.

[16] Zicha S,Xiao L,Stafford S,etal.Transmural expression of transient outward potassium current subunits in normal and failing canine and human hearts[J].Physiology,2004,561(Pt3):735-748.

[17] Murali SS,Napier IA,Rycroft BK,etal.Opioid-related(ORL1) receptors are enriched in a subpopulation of sensory neurons and prolonged activation produces no functional loss of surface N-type calcium channels[J].J Physiol,2012,590(7):1655-1667.

[18] Popiolek-Barczyk K,Rojewska E,Jurga AM,etal. Minocycline enhances the effectiveness of nociceptin/orphanin FQ during neuropathic pain[J].Biomed Res Int,2014,2014:762930.

[19] Gunduz O,Karadag HC,Ulugol A.Synergistic anti-allodynic effects of nociceptin/orphanin-FQ and cannabinoid systems in neuropathic mice[J].Pharmacol Biochem Behav,2011,99(4):540-544.

[20] Sukhtankar DD,Zaveri NT,Husbands SM,etal.Effects of spinally administered bifunctionalnociceptin/orphanin FQ peptide receptor/μ-opioid receptor ligands in mouse models of neuropathic and inflammatory pain[J].J Pharmacol Exp Ther,2013,346(1):11-22.

[21] Sotgiu ML,Bellomi P, Biella GE.Efficacy of nociceptin inhibition on WDR neuron activity is enhanced in mononeuropathic rats[J].Brain Res,2004,998(2):251-254.

[22] Ju J,Shin DJ,Na YC,etal.Role of spinal opioid receptor on the antiallodynic effect of intrathecal nociceptin in neuropathic rat[J].Neurosci Lett,2013,542:118-122.

[23] Christoph T,Koch T,Tzschentke TM,etal.Interactions of opioid and nociceptin/orphaninFQ (NOP) receptors in acute nociception and diabetic heat hyperalgesia as revealed in opioid/NOP receptor knockout mice[C]. Florence,Italy: EFIC-8th ‘Pain in Europe’Congress,,2013:Abs 600.

[24] Tao R,Ma Z,Thakkar MM,etal.Nociceptin/orphanin FQ decreases serotonin efflux in the rat brain but in contrast to a kappa-opioid has no antagonistic effect on mu-opioid-induced increases in serotonin efflux[J].Neuroscience,2007,147(1):106-116.

[25] Pan Z,Hirakawa N,Fields HL.A cellular mechanism for the bidirectional pain-modulating actions of orphanin FQ/nociceptin[J].Neuron,2000,26(2):515-522.

[26] Fu X, Wang YQ,Wang J,etal.Changes in expression of nociceptin/orphanin FQ and its receptor in spinal dorsal horn during electroacupuncture treatment for peripheral inflammatory pain in rats[J].Peptides,2007,28(6):1220-1228.

[27] Kiguchi N,Ding H,Ko MC.Central N/OFQ-NOP receptor system in pain modulation[J].Adv Pharmacol,2016,75:217-243.

[28] Yu LC,Lu JT,Huang YH,etal.Involvement of endogenous opioid systems in nociceptin-induced spinal antinociception in rats[J].Brain Res,2002,945(1):88-96.

[29] Ding H,Hayashida K,Suto T,etal.Supraspinal actions of nociceptin/orphanin FQ,morphine and substance P in regulating pain and itch in non-human primates[J].Br J Pharmacol, 2015,172(13):3302-3312.

[30] Witkin JM, Statnick MA, Rorick-Kehn LM,etal.The biology of nociceptin/orphanin FQ (N/OFQ) related to obesity, stress, anxiety, mood, and drug dependence[J].Pharmacol Ther,2014,141(3):283-299.

[31] Schröder W,Lambert DG,Ko MC,etal.Functional plasticity of theN/OFQ-NOP receptorsystem determines analgesicpropertiesof NOPreceptor agonists[J].Br J Pharmacol,2014,171(16):3777-3800.