CRISPR/Cas9基因编辑技术应用现状

□段莹星

（河南师范大学生命科学学院 河南 新乡 453007）

1 CRISPR/Cas9基因编辑技术简介

基因编辑技术已经发展更新了四代，分别是：ZFNS编辑技术、TALENS编辑技术、MGN编辑技术、CRISPR/Cas系统，本文着重介绍CRISPR/Cas9技术。21世纪初期，古细菌和真菌的对抗外来病毒的免疫方法被科学家在相关研究中发现，起主要作用的是细菌基因组的成簇规律重复间隔短回文序列(CRISPR)和能够切割外源DNA片段的Cas蛋白。CRISPR/Cas9技术工作的原理是：CRISPR/Cas系统将病毒的基因整合到CRISPR的间隔序列中，记忆保存，当同种基因序列入侵时，可以实现快速准确特异切割。具体方法：外源基因组的三个保守核苷酸NGG（N可以为任何核苷酸）又称为PAM(Protospacer adjacent motifs)基序，该基序可以被向导RNA(sgRNA)识别，sgRNA引导Cas9蛋白在PAM上游切割。断链的DNA有两种修复方式即非同源末端链接和同源末端链接，其中非同源末端连接的修复方式可以大大提升突变效率。由于CRISPR的向导RNA只需要20多个核苷酸序列就能识别到PAM基序，并且Cas9蛋白单聚体就能发挥作用，操作简单方便，定位精准，所以CRISPR/Cas9基因编辑技术被广泛应用在植物基因编辑中。

2 CRISPR/Cas9基因编辑技术的应用

2.1 改良农作物品质

利用CRISPR/Cas9技术在植物体内进行基因编辑的技术路线一共分为五步：（1）确定靶标基因组，选择20bp的靶标序列连接PAM；（2）设计与靶序列配对的sgRNA序列；（3）把sgRNA和Cas蛋白连接起来；（4）通过农杆菌转移法等方法转入植物；（5）获得转基因植物。

多种模式植物、农作物和经济作物已经通过CRISPR/Cas9基因编辑技术做到了基因改造，实现了农作物基因改良。例如：玉米的Zm IPK基因改造后植酸合成更合理；烟草Nt PDS基因改造后叶片黄化减轻；水稻Os SWEET1a等基因改造后，细菌性白叶枯病抗性增强；番茄Sl ANT1基因改造后，组织过表达花青素等。已公布研究表示，CRISPR/Cas9技术可以实现调控植物代谢过程、抗病性增强等，为开发更容易成活、经济效益更高的农作物提供了有力的工具[1]。

2.2 在基因工程育种中的研究应用

实验证明，磺酰脲类和苯达松类除草剂对水稻没有作用，原因是水稻的bel基因对这两类药物有抗性。经过CRISPR/Cas9技术的敲除，构建特异性的sgRNA序列和Cas蛋白，突变株的性状有所改善。其中，同源修复的纯合突变株，表现为对磺酰脲类和苯达松类除草剂敏感。由于CRISPR/Cas9技术可以进行多基因位点编辑，所以其在多倍体上也有应用。例如玉米植酸，一旦不能被动物消化，经排泄就会对环境造成危害。科学家就针对玉米植酸合成的关键基因进行了敲除，并且获得了不同突变率的突变体，为提供更适宜人类农业发展需要的植物物种提供了思路[2]。

2.3 植物基因功能研究中的应用

CRISPR/Cas9基因编辑技术提供了鉴定基因功能的思路。要知道某物种基因组中特定基因的功能，可以利用CRISPR/Cas9基因编辑技术把此物种基因组的靶基因敲掉（如上文所介绍的基因敲除）。对比观察编辑前后植株的性状及生理特点，可以达到估计基因功能的目的。此外，上文提到的编辑水稻bel基因，转化方式是影响CRISPR/Cas9编辑效率的重要因素，使用基因枪法转化sgRNA序列和Cas蛋白会获得更高的突变效率，有助于多个基因的定点插入。单基因定点编辑，使用农杆菌转化法效率更高。

结束语

CRISPR/Cas9基因编辑技术是新型生物技术的代表，自其发现以来，应用和研究在不断地深化，在农作物品种改良、基因工程育种、基因工程育种中的研究办法、植物基因功能的研究等多个领域都有了重要突破。从科学的角度看，通过基因编辑技术得到的转基因植物可能不会带来更高的健康风险或环境危害，但是怎么利用基因编辑技术是我们都应该思考的问题，也为监管工作带来了更大挑战。

[1]郝丽芬,等.CRISPER/Cas9基因编辑技术及在农作物品种改良研究中的应用[J].北方农业学报,2017,45(3)：29-35.

[2]姚祝平,等.CRISPER/Cas9基因编辑技术在植物基因工程育种中的应用[J].分子植物育种,2017,45,(7)：2647-2655.