广泛期与局限期小细胞肺癌差异表达miRNAs的筛选及生物信息学分析

薛亚军，耿涛，黄冰，罗波，魏育涛

(石河子大学医学院第一附属医院，新疆石河子832000)

小细胞肺癌(SCLC)具有高度侵袭性，早期即可通过血液循环及淋巴结转移至多个脏器，其易发生转移的确切机制目前仍不清楚。miRNAs是一组长度为20～22个核苷酸的内源性非编码小分子RNA，通过与靶基因的3′-非编码区(3′-UTR)结合调控基因表达[1]。目前在人体中已发现1 880多个miRNAs，约30%的人类蛋白编码基因受miRNAs调控[2]。异常表达的miRNAs与人类多种肿瘤的转移密切相关[3]。研究发现，位于靶基因3′-UTR中的单核苷酸可调控miRNAs与靶基因的结合，进而调控SCLC的发生、发展[4]；miRNAs在血浆或血清中的稳定性良好，能对抗RNA酶降解[5]，有望成为早期SCLC诊断、治疗及患者预后判断的理想非侵入性生物标志物。基因芯片是一种快速有效检测miRNAs表达谱的技术。2015年4月～2016年12月，我们利用基因芯片技术筛选广泛期与局限期SCLC间差异表达miRNAs，现分析结果，探讨SCLC转移过程中整个基因组及信号通路的变化。

1　材料与方法

1.1基因表达数据在高通量基因表达数据库(GEO)检索框中以“small cell lung cancer”和“metastasis”为检索词，获得GSE67804芯片数据。GSE67804所用的实验平台为Illumina公司的Agilent-038166 cbc_human_miR18.0芯片。采用6例SCLC患者的血清样本，其中3例为广泛期SCLC(ED组)，3例为局限期SCLC(LD组)。登录号GSM1656377～GSM1656379为ED组样本，登录号GSM1656380～GSM1656382为LD组样本。

1.2数据过滤、标准化及差异miRNAs筛选将GEO中下载的数据集导入Qlucore Omics Explorer3.0软件；对数据信息进行标准化处理(平均数为0，标准差为1)，两组样本间比较采用t检验，对数据信息进行有效过滤。筛选出差异miRNAs，差异miRNAs的筛选条件为P<0.05，差异倍数 |Fold change|≥2。

1.3差异基因的GO富集分析和通路分析利用TargetScan、miRDB、miRTarBase对差异miRNAs进行综合靶基因预测，取至少2个以上软件预测得到的基因作为靶基因。将筛选出的差异基因输入到DAVID数据库(http：//david.abcc.ncifcrf.gov/home. jsp)进行GO分析及KEGG信号通路分析，通过Fisher Exact Test计算P值，P<0.05为差异有统计学意义。

1.4差异基因的STRING蛋白相互作用分析将差异基因导入String10.0在线分析网站http://string-db.org/)，将最低互作分值设置成高度可信(high confidence: 0.7)，进行靶基因的蛋白质相互作用网络分析。

2　结果

2.1两组血清中差异miRNAs筛选ED组与LD组共筛选出17个差异miRNAs(P<0.05，|Fold change|≥2)，预测出1 421个靶基因。

2.2差异miRNAs靶基因的GO分析ED组较LD组差异miRNAs所对应的靶基因共参与24项显著性功能，包括RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控，DNA模板转录及信号传导等生物学过程(BP)，蛋白结合、DNA结合、转录因子活性及序列特异性DNA结合等分子功能(MF)，核质、细胞质及高尔基体等细胞组件(CC)。见表1。

2.3差异miRNAs靶基因参与的KEGG富集分析ED组与LD组差异miRNAs所对应的靶基因共参与19条显著性信号通路，包括恶性肿瘤通路、胞吞作用、Ras信号通路、胆碱代谢、Rap1信号通路、调节干细胞多能性信号通路、SCLC、FoxO信号通路、mRNA监视通路、PI3K-Akt信号通路、cAMP信号通路以及ErbB信号通路等。见图1。

图1　差异表达miRNAs靶基因的KEGG富集分析

2.4靶基因编码蛋白间的相互作用通过靶基因的GO和KEGG pathway分析，得到显著性GO和显著性信号通路及其所属的靶基因，取显著性GO的靶基因和显著性信号通路的靶基因交集，将这些靶基因集合汇总后通过STRING10.0在线分析软件(http://string-db.org/)构建蛋白互作网络。蛋白互作网络分析显示，在差异miRNAs靶基因编码蛋白互作网络中，靶基因信号传导及转录激活因子(STAT3)、SMAD3、E2F1、基质金属蛋白2(MMP2)、SP1、雄激素受体(AR)、胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)、核因子κB1(NFκB1)、蛋白激酶2(AKT2)编码蛋白在网络中具有核心地位。

3　讨论

SCLC转移是多基因参与并调控的复杂生物学过程，分子间相互作用的调节在SCLC转移形成中的具体作用及作用机制尚未明确。因此，结合基因芯片表达数据的挖掘及生物信息学分析，从分子水平揭示SCLC转移的本质，研究SCLC转移相关基因，可为更好地理解SCLC转移进展、恶化机制提供有益的向导性线索。研究证实，miRNAs可作为肿瘤的促进因子调控细胞增殖、侵袭、转移和血管生成等[6]，并参与肺癌的发生、发展、转移及预后等整个过程[7]。本研究利用Qlucore Omics Explorer3.0软件对芯片数据进行挖掘共筛选出17个差异miRNAs；差异miRNAs所预测靶基因的GO和KEGG富集分析结果中，GO富集结果提示这些miRNAs可能通过调控肿瘤细胞的转录、转录因子结合及激活、细胞连接以及细胞内受体信号通路等影响癌细胞的转移。KEGG结果显示，差异表达miRNAs的靶基因显著富集于胞吞作用、Ras信号通路、Rap1信号通路、PI3K-Akt信号通路以及局部黏附通路等肿瘤相关信号通路。研究表明，在胞吞通路中关键蛋白发生功能紊乱可能导致肿瘤的发生，如衔接蛋白Epsins在肺癌中高表达，可以促进肿瘤细胞的侵袭[8]。Ras信号通路与多种肿瘤的发生、发展和转移密切相关。McCubrey等[9]在结肠癌、卵巢癌、黑素瘤等肿瘤中发现了Ras突变。在Rap1信号通路中，Rap1b也可在多种肿瘤中表达上调，激活Rap1b，促进血管生成、内皮细胞迁移及增殖，与肿瘤转移密切相关[10]。PI3K-AKT 通路可通过MMPs活化诱导肿瘤细胞的侵袭，增加细胞的转移能力[11]。Akca 等[12]研究发现，PI3K-AKT通路的活化可导致肺癌细胞的侵袭能力增强。局部黏附通路能够影响细胞的增殖、黏附，与肿瘤的侵袭和转移相关[13]。这些结果说明胞吞作用、Ras通路、Rap1通路、PI3K-Akt通路及局部黏附通路等信号通路异常可能是SCLC转移的重要环节。而这些通路彼此之间是否会互相影响，也值得深入研究。

表1　差异miRNAs靶基因的GO富集分析

注：E(代表指数)表示将前面的数字乘以10的n次幂。例:2.33E-08=2.33×10-8=0.000 000 023 3。

STRING蛋白互作分析结果显示，差异miRNAs主要调控STAT3、SMAD3、E2F1、MMP2、SP1、AR、IGF1R、NFKB1、AKT2等关键靶蛋白表达。STAT3与恶性肿瘤的发生、发展及转移密切相关[14]，STAT3激活可促进SMAD3表达，增加肺癌细胞迁移和侵入[15]。在95%的SCLC组织中E2F1表达升高，参与细胞黏附、细胞迁移、血管生成、侵袭转移，并在转录后激活SP1和NF-κB[16]，通过调控MMPs表达发挥促侵袭转移作用[17]。研究发现，MMPs家族的MMP2对肺癌侵袭和淋巴结转移有促进作用[18]；SP1可通过调控肿瘤相关基因E2F1、MMP2表达而影响肿瘤的生长和转移[19]；胰岛素样生长因子(IGF)和胰岛素样生长因子受体(IGFR)在SCLC中均呈高表达[20]；AR在肺癌中的表达提示患者预后可能更差[21]；AKT2在促进肿瘤细胞转移方面发挥重要功能[22]，并可通过促进IGF1R表达使胰腺癌细胞运动增加[23]。上述研究中的蛋白与我们通过STRING预测处于核心地位的靶蛋白相吻合，提示这些靶蛋白很可能是SCLC转移相关调控途径的关键蛋白。

综上所述，本研究通过对SCLC转移相关基因芯片数据GSE67804的挖掘，筛选出17个差异表达miRNAs，它们通过调控胞吞作用、Ras通路、Rap1通路、PI3K-AKT通路、局部黏附通路以及STAT3、SMAD3、E2F1、MMP2、SP1、AR、IGF1R、NFKB1和AKT2等蛋白表达在SCLC广泛转移的发生、发展过程中发挥重要作用。上述差异表达miRNAs为SCLC广泛转移的早期诊断和治疗提供了可能的生物标志物，并且为研究SCLC广泛转移发生的分子机制遴选出重要的信号通路及关键蛋白。

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