6种光学透明化方法在大鼠脑组织块的透明效果比较

欧毅超，冯展鹏，武广森，张 源，包 赟，邱炳辉，刘亚伟，漆松涛*

(1.南方医科大学南方医院神经外科，广州 510515； 2.南方医科大学第一临床医学院，广州 510515)

三维结构的研究对阐述组织结构形态学、毗邻组织的解剖关系、细胞分子层面的生理功能有至关重要的作用。然而，因为光散射效应和厚组织片成像困难等原因，在组织学研究时，通常将样品制成薄切片，从平面观察和描述细胞、组织的信息，导致了生物体三维结构的信息缺失。曾有生物学家尝试应用阵列断层扫描技术对切片成像进行三维重建，但耗时耗力，效果有限[1]。因此研究者们设想在不切片和不损毁组织的前提下，进行组织的立体成像，并且可对同一个样品进行多次成像。首先，限制的客观条件是，组织过厚，一些组织中存在着色素，使组织有颜色。此外，研究者面对最困难的问题是，大多数生物组织为实质不透光，这些特性削弱了组织块成像的清晰度，也是观察深层结构的最大阻碍。

出于各种需求，研究者们在20世纪末便开展了许多组织透明化的尝试。所有组织透明化技术的关键是如何使光透过样品时与介质的折射率相匹配，以减少光在组织中的不均匀散射。现阶段的方法大致可分为2大类：溶剂型和水基型透明化，前者如BABB、3DISCO、iDISCO[2]等；后者又分为单纯浸泡法，如SeeDB[3]、FRUIT、TDE等；水化法，如Scale A2、Scale U2、CUBIC[4]等；水凝胶嵌入法，如CLARITY、PACT、PARS等。以上方法各有利弊，目前，在国内开展组织透明化技术并不多，对这些透明方法的比较报道更鲜有报道。在此，我们分别从各类型中选取较为代表性的方法，iDISCO(immunolabeling-enabled three-dimensional imaging of solvent-cleared organs)、SeeDB(See Deep Brain)、CUBIC(clear, unobstructed brain/body imaging cocktails and computational analysis)、SCALEVIEW-A2、CLARITY-CUBIC(the clear, lipid-exchanged, acrylamide-hybridized rigid, imaging/ immunostaining compatible, tissue hydrogel-CUBIC)、Passive CLARITY(passive and the clear, lipid-exchanged, acrylamide-hybridized rigid, imaging/ immunostaining compatible, tissue hydrogel)，共6个方法对大鼠脑组织块透明化的效果进行比较。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级SD雄性大鼠14只，8～10周龄，体重220～240 g，南方医科大学实验动物中心提供[SCXK(粤)2011-0015]，大鼠脑组织取材于南方医科大学南方医院进行[SYXK(粤)2015-0056]，并通过南方医院实验动物伦理委员会审查[NFYY-2014-88].

1.2 主要试剂及仪器

生理盐水； PBS粉末(Fisher公司，货号BP399-1)；多聚甲醛粉末；甲醇；去离子水；盐酸；氢氧化钠；叠氮钠；30%H2O2；DMSO；TritonX-100(Sigma公司)；肝素(Sigma公司，货号H3393)；四氢呋喃(THF，Sigma公司，货号186562)；二氯甲烷(Sigma公司，货号270997)；二苄基醚(Sigma公司，货号108014)；果糖；α-硫代甘油(Sigma公司)；SCALEVIEW-A2溶液(Olympus公司)；O.C.T.(Sakura公司)；四羟丙基乙二胺(Quadrol，Sigma公司)；尿素(Sigma公司)；三乙醇胺(Solarbio公司)；硅油(Sigma公司)；矿物油(Solarbio公司)；甘油；VA-044引发剂(WAKO公司，货号VA-044)；丙烯酰胺(Sigma公司)；双甲叉丙烯酰胺(Sigma公司)；十二烷基硫酸钠(SDS)；2,2’-硫代双乙醇(Sigma公司，货号166782)；硼酸(Sigma公司，B7901)；易氟烷。

涂硅帽玻璃细颈瓶(Thermo Fisher公司，货号C326-0020)，低尘纸(Kimwipe公司)；真空干燥装置；水平摇床；跷板摇床；试管旋转器；磁力加热搅拌器；恒温箱；pH计；动物吸入麻醉机。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组

14只SD雄性大鼠随机分为7组：PBS组、iDISCO组、SeeDB组、CUBIC组、SCALEVIEW-A2组、CLARITY-CUBIC组、Passive CLARITY组，接受不同的透明化方法。

1.3.2 脑组织块的准备

除CLARITY-CUBIC组外，其余6组共12只 SD大鼠吸入麻醉后，经心尖灌注含有肝素的生理盐水(200 mg/500 mL)，待到大鼠体内血液被置换完全，改用冰冻的4%多聚甲醛灌注固定，灌注完成后去除脑部皮肤及骨头取出鼠脑，用大鼠脑模具冠状切修整2 mm，然后每个鼠脑沿正中矢状线对半切，每只大鼠取前、中、后大脑半球双侧可得6个脑组织块，即12个组织块每组，在4℃ 4%多聚甲醛浸泡保存备用。CLARITY-CUBIC方法组，先用生理盐水灌注后，再继续灌注水凝胶溶液，约200 mL每只(配方见后述)，取脑备用。

1.3.3 透明方法试剂的配备

iDISCO法所需配备的试剂有：50%甲醇(1体积无水甲醇与1体积0.01 mmol/L PBS混合)；80%甲醇(4体积无水甲醇与1体积0.01 mmol/L PBS混合)；100%甲醇；5% H2O2/20% DMSO/甲醇(1体积30% H2O2与1体积DMSO与4体积甲醇混合)；20% DMSO/甲醇(1体积DMSO与4体积无水甲醇混合)；0.2% PBST (1体积TritonX-100 与500体积0.01 mmol/L PBS混合)；50%四氢呋喃/H2O(1体积四氢呋喃与1体积双蒸水混合)；80%四氢呋喃/H2O(4体积四氢呋喃与1体积去离子水混合)；100%四氢呋喃(THF)；二氯甲烷(DCM)；二苄基醚(DBE)。以上溶液室温保存。

SeeDB法所需配备的试剂有：20%果糖(4 g果糖加去离子水至20 mL)；40%果糖(8 g果糖加去离子水至20 mL)；60%果糖(12 g果糖加去离子水至20 mL)；80%果糖(16 g果糖加去离子水至20 mL)；100%果糖(20 g果糖加去离子水至20 mL；SeeDB溶液(20.25 g果糖加5 mL去离子水)；SeeDB37(27 g果糖加5 mL去离子水)以上每份20 mL溶液均需加入100 μL α-硫代甘油以避免梅拉德反应。以上溶液配备后短期内使用。

CUBIC法所需配备的试剂有：80% Quadrol(125 g去离子水加入500 g Quadrol，加热混合)；ScaleCUBIC-1(也称为reagent-1，将125 g尿素与156 g 80% Quadrol在144 g去离子水中加热搅拌，充分溶解后冷却至室温，再加入75 g TrionX-100同时搅拌，使用真空泵排气处理30 min，压力调至0.1 MPa，配成500 g reagent-1溶液)；1/2 reagent-1(reagent-1与去离子水1∶1混合)；ScaleCUBIC-2(也称为reagent-2，将25 g蔗糖与12.5 g尿素在7.5 g去离子水中加热搅拌，充分溶解后冷却至室温，再加入5 g三乙醇胺同时搅拌，使用真空泵排气处理30 min，压力调至0.1 MPa，配成50 g reagent-2溶液)；1/2 reagent-2(reagent-2与0.01 mmol/L PBS溶液1∶1混合)；浸泡混合油(1∶1混合矿物油与硅油)。以上溶液均可室温存放，若出现强烈尿素气味时应重配溶液。

SCALEVIEW-A2法所需配备的试剂有：SCALEVIEW-A2溶液为商品制品；20%蔗糖(100 g蔗糖溶解至500 mL 0.01 mmol/L PBS中)。

CLARITY-CUBIC法所需配备的试剂有：4℃ 16% PFA溶液；VA-044溶液(125 mg VA-044引发剂溶解在26.25 mL去离子水，4℃保存)；4℃ 40%丙烯酰胺溶液；4℃ 2%双甲叉丙烯酰胺溶液；0.1 mmol/L PBS溶液；水凝胶溶液(将26.25 mL VA-044溶液、16% PFA12.5 mL、40%丙烯酰胺5 mL、2%双甲叉丙烯酰胺1.25 mL、0.1 mmol/L PBS 5 mL在冰上混合，配成50 mL溶液)；CUBIC透明液(将3.85 g尿素、3.85 g四羟丙基乙二胺在5.38 mL去离子水中加热搅拌混匀，充分溶解冷却室温后加入2.31 g TritonX-100，配成10 g溶液)；85%甘油。以上溶液均需4℃保存。

Passive CLARITY法所需配备的试剂有：水凝胶溶液(各成分的终浓度：0.01 mmol/L PBS，4% PFA，4%丙烯酰胺，0.05%双甲叉丙烯酰胺，0.25% VA-044引发剂)；透明液(各成分的终浓度：硼酸200 mmol/L，4% SDS)，以上溶液均需4℃保存。

1.3.4 透明化方法的步骤

iDISCO[2](甲醇处理法)：(1)甲醇预处理：取4% PFA固定的脑片，经PBS漂洗2次，每次1 h，然后分别经50%甲醇、80%甲醇、100%甲醇梯度浸泡各1 h，更换100%甲醇浸泡1 h，再经5% H2O2/20% DMSO/甲醇混合溶液漂白，4℃过夜。第二天，更换100%甲醇漂洗2次，每次1 h，再换20% DMSO/甲醇混合溶液漂洗2次，每次1 h，接着依次更换80%甲醇、50%甲醇、PBS漂洗，每次1 h，使用PBS再次漂洗1 h，最后放入0.2% PBST漂洗2次，每次1 h后备用。(2)组织透明化：经预处理的脑片，分别放入50% THF 10 mL的玻璃瓶中，室温过夜。第二天，更换80% THF/H2O混合溶液10 mL孵育1 h后，更换100% THF 10 mL孵育2次，每次1 h，最后用Kimwipe纸轻拭干残留液体后，放入装满DCM的玻璃瓶中孵育。样品沉底后再放入DBE溶液中至透明(抽真空排出气体后，静置2 h左右)，然后在DBE溶液中室温保存。

SeeDB[3](标准法):取4% PFA固定后的脑片，PBS漂洗3次，每次10 min，每个组织块分别依次置入20 mL的20%果糖、40%果糖、60%果糖孵育各4～8 h，再置入80%果糖，100%果糖20 mL孵育各12 h，最后置入20 mL SeeDB溶液孵育24 h，不超过48 h。然后放置入SeeDB37溶液，37℃孵育24 h。以上孵育过程均需在试管旋转器上或翘板摇床上进行。最后将组织块浸泡在水或者在30%甘油中观察。

图1 几种组织光学透明方法的实验流程图Fig.1 Schematic flow chart of clearing process by different tissue optical clearing protocols for rat brain tissues

CUBIC[4](简单浸泡法)：取4% PFA固定的脑片，经PBS漂洗2次，每次2 h以清洗残余的PFA，脑组织块分别置入8～10 mL的1/2 reagent-1溶液，在37℃摇荡浸泡，3～6 h后弃液，马上换等量reagent-1溶液于37℃下浸泡过夜。翌日，换等量的reagent-1在同等条件中浸泡，之后以每2 d更换一次reagent-1。待第7天结束，终止透明进程，换PBS漂洗3次，每次2 h后，在PBS中浸泡过夜。第二天，弃剩少量PBS，放入真空箱中抽真空30 min以去除气体。完成后将脑组织块置入5 mL 1/2 reagent-2溶液，37℃浸泡6～24 h，至组织块沉底后换5 mL reagent-2溶液，37℃过夜。翌日，再换一次5 mL reagent-2溶液备用。以上步骤均使用跷板摇床孵育、漂洗。观察前用Kimwipe去除残余溶液，浸泡至混合油溶液中10 min至1 h。

SCALEVIEW-A2[5]：取4% PFA固定的脑片，放入20%蔗糖中，37℃浸泡24 h，再用OCT混合物包埋后放入-80℃冰箱。翌日，取出并待融化后用PBS漂洗干净，重新用4% PFA室温固定20 min。然后用15 mL SCALEVIEW-A2分别浸泡脑组织块，每天换一次液，持续7 d，孵育过程均需在摇床上进行。最后泡在新鲜SCALEVIEW-A2溶液中观察。

CLARITY-CUBIC[6]：取经水凝胶灌注的脑组织，分别置入15 mL水凝胶中，4℃过夜。翌日，弃10 mL水凝胶溶液，将剩余的5 mL液体与组织块倒入5 mL管中，加水凝胶至略高出瓶口，再用封口膜封好放入37℃烘箱过夜。翌日，取出凝固的水凝胶与脑组织块，用Kimwipe轻拭去除残余的水凝胶，再用PBS漂洗4次共24 h后，放入5 mLCUBIC透明液中，在37℃烘箱中振荡孵育3 d后，再用PBST漂洗6次共24 h以备用。最后浸泡至混合油溶液中观察。

Passive CLARITY[7]：取4% PFA固定的脑片，分别置入40 mL水凝胶溶液中，在4℃摇床中孵育7 d。(1)聚合反应步骤：孵育完毕，去除20 mL水凝胶后，将样品与溶液置于真空箱内，抽真空30 min后，在37℃水浴锅里进行3 h的聚合反应，完成后用Kimwipe轻拭干净。(2)去脂反应：每个聚合样品置入40 mL透明液中，45℃烘箱振荡孵育，前7 天每天换液一次。以后在40℃烘箱震荡孵育，每2～3 d换液一次，至透明，耗时4～6周。

以上6种方法实验流程见图1。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 不同方法透明大鼠脑组织成像

如图2所示，PBS处理的脑组织块前后无明显的改变。iDISCO方法处理的脑组织块变得透明、匀称、背后标格清晰对称无偏差，略成毛玻璃样。SeeDB方法处理的组织与之前比较略有透光，背后标格不清晰。CUBIC方法的处理相对其他各组最透明透光，皮层基本和背景一致，胼胝体和白质纤维可肉眼观察到，边缘略不平整。SCALEVIEW-A2透明液处理的组织略透明，皮质可隐约看到背后的标格，而白质基本不透光。而CLARITY-CUBIC与Passive CLARITY均有水凝胶在表面，脑组织相对透光，可见背后网格。

2.2 不同透明方法处理的脑组织块大小改变及透明效果评估

透明度用灰度值(INT)表示，PBS为13.031±0.586，iDISCO 为6.447±0.574，SeeDB为11.690±0.909，CUBIC为2.318±0.986，SCALEVIEW-A2为8.118±1.026，CLARITY-CUBIC为8.591±0.384，Passive-CLARITY为4.198±0.182；与PBS组比较，除了SeeDB组差异无显著性外(P=0.185)，其余各组均较PBS组有显著性差异(P< 0.01)。使用LSD法比较，iDISCO分别与SeeDB、CUBIC有显著性差异(P< 0.01)，SeeDB分别与CUBIC、SCALEVIEW-A2、CLARITY-CUBIC，Passive-CLARITY有显著性差异(P< 0.01)，CUBIC分别与SCALEVIEW-A2、CLARITY-CUBIC，Passive-CLARITY有显著性差异(P< 0.01)。(图3A)

经透明化处理后，iDISCO组面积改变为(-30.02±2.39)%，SeeDB为(19.74±4.09)%, CUBIC为(14.7±3.92)%，SCALEVIEW-A2为(10.7±5.55)%，CLARITY-CUBIC为(23.01±4.19)%，Passive-CLARITY为(66.51±5.68)%，各组面积改变均较iDISCO组、Passive-CLARITY组有显著性差异(P< 0.01)。(图3B)

注：A: 不同方法的处理后组织透明度灰度值比较；B: 不同方法的处理后面积改变比较。P: PBS组; I: iDISCO组; S: SeeDB组; C: CUBIC组; SV: SCALEVIEW-A2组; CC: CLARITY -CUBIC组; PC: passive clarity组。与PBS组比较，*P< 0.01；iDISCO组比较，#P< 0.01；SeeDB组比较，†P< 0.01；CUBIC组比较，P< 0.01；Passive-CLARITY组比较，ξP< 0.01。图3 不同透明化方法处理大鼠脑组织块的透明度灰度值与面积改变Note.A: INT index. B: Changes of area after different treatments. P: PBS group.I: iDISCO group.S: SeeDB group.C: CUBIC group.SV: SCALEVIEW-A2 group.CC: CLARITY-CUBIC group.PC: passive CLARITY group. Compared with the PBS group, *P< 0.01. Compared with the iDISCO group, #P< 0.01. Compared with the SeeDB group，†P< 0.01. Compared with the CUBIC group, P< 0.01. Compared with the Passive-CLARITY group, ξP< 0.01.Fig.3 The INT index and area changes after processing with different optical tissue clearing methods on rat brain tissue blocks

3 讨论

本研究讨论了不同组织透明化方法的效果。现有的组织透明化方法大概可分为2大类：溶剂型与水基型透明化，前者由1914年Spalteholz[8]的方法改进而来，常用的方法有BABB、3DISCO、iDISCO等，其中iDISCO为3DISCO的改良，同时适用于组织的免疫荧光染色。简而言之，溶剂型透明化有主要两个步骤：第一步是用脂溶剂脱水，第二步用不同的脂溶剂匹配已经脂剂脱水组织折光率，使之一致，达到透明化效果[9-11]。水基型透明化方法又可分为(1)简单沉浸法；(2)水化法；(3)水凝胶嵌入法等。此透明法主要是围绕以下核心机制：(1)被动沉浸在溶液中直至折射率与组织匹配；(2)水化反应后去除脂质，以降低折射率，或者(3)主动或被动去除脂质后，沉浸在折光率匹配的介质中(refractive index matched solution, RIMs)。简单沉浸法包括：Sucrose、FocusClear、ClearT[12]、ClearT2、SeeDB、FRUIT、TDE[13]等，水化法包括：Scale A2、Scale U2、CUBIC，以及商品化的SCALEVIEW-A2等。水凝胶法包括有始创的CLARITY[14-15]，和后续的PACT/PARS-CLARITY，Passive-CLARITY，还有改良的CLARITY-CUBIC方法等，近几年以水凝胶法开发的新透明化方法不断增多。在本次实验中，以透明周期、透明效果、透明后组织面积改变等指标进行研究，对四类的组织透明化方法进行比较。

在本研究中，溶剂型iDISCO方法可在1周内完成，水基型中单纯沉浸(SeeDB)及水化法(SCALEVIEW-A2、CUBIC)透明周期在1～2周之间，而passive CLARITY方法则需耗时4～6周。透明周期不同的主要原因在于透明原理的差异。溶剂型iDISCO法是通过脂溶剂脱水后，继而利用脂溶剂匹配已脱水的组织块，使其达到折光率一致，针对性强，耗时短。水基型透明法中单纯沉浸(SeeDB)及水化法(SCALEVIEW-A2、CUBIC)是通过被动沉浸在溶液或者水化去脂，以降低折射率，最后浸泡在折光率相匹配的介质中达到透明效果，用时约在1～2周。而Passive-CLARITY及CLARITY-CUBIC方法都是基于水凝胶嵌入CLARITY[15]方法改进而来。CLARITY方法的局限性在于电泳仪的使用，与一般的蛋白电泳仪不同，主动电泳去脂有特殊的要求，电泳的电压把握不好便会破坏组织，时间过短或过长会导致透明不彻底和过度膨胀，技术的操控性是所有透明化中最难开展的，所以本实验并无对此法进行探讨，而是选择了水凝胶的被动透明(Passive-CLARITY)和改良法(CLARITY-CUBIC)。CLARITY-CUBIC法在组织经过水凝胶灌注之后，通过高浓度的洗涤剂去除组织中脂质，从而缩短了组织透明的时间，但这也导致了大量蛋白丢失的问题。而在Passive CLARITY方法中，脑组织在经过水凝胶嵌入、聚合反应后，使用被动去脂的方法(8% SDS洗涤剂等)，达到透明化的效果。这种去脂方法较为温和，对组织样品蛋白的破坏较小，但是耗时较长。

通过对组织透明化后的灰度分析，我们发现透明效果最好的是CUBIC法，其次为iDISCO及Passive-CLARITY法，SCALEVIEW-A2及CLARITY-CUBIC法的透明效果尚可，而SeeDB在本研究中未能实现透明效果。水基型水化-透明化CUBIC法是通过水化反应，对样品去脂同时降低折射率。使用尿素用以穿透和变性组织，水合作用减少了总体折光率降至1.38，最后利用混合油(1∶1混合矿物油与硅油)匹配折光率到达很好的透明效果[4]。同为水化法的SCALEVIEW-A2是一步法透明，且SCALEVIEW-A2溶液较稀，折光率较小，可能透明效果较CUBIC差的因素之一。溶剂型iDISCO法通过脂溶性溶液脱水常会使折光率大于1.5(远高于脂性溶液与水)，在脂性脱水后紧接着浸泡另一组脂性溶液，并且选择的溶液具有均匀嵌合到组织中的特性，以达到透明效果[2]。Passive CLARITY亦可以到达较好的透明效果，但是耗时长。而单纯沉浸的SeeDB法通过组织样品置入一系列水溶液，包括可溶的，高折射率的化学剂使之逐渐透明，主要试剂有蔗糖、果糖、甘油、2,2’-硫二甘醇(TDE)、甲酰胺等。这种被动透明方法相对其他透明方法效果较差，在本实验中也证实了这一点，灰度值分析与PBS组差异无显著性，所以此方法较适宜用在相对较薄的小样品中。

组织透明化产生的初衷是为了立体地观察组织的三维结构，但是我们发现在组织透明化的过程中，脑组织会出现皱缩或者膨胀的现象，这种形态的变化可能会改变组织内部原本的三维结构，不利于后续研究，因此本研究中探讨了不同透明化方法后组织面积改变的差异。我们发现溶剂型iDISCO法处理后组织皱缩，而经水基型透明化法后组织均出现不同程度的膨胀，其中Passive-CLARITY法膨胀最为明显。这是因为溶剂型透明法通过脂溶性溶液脱水导致组织皱缩，得到高折光率的透明组织样品。在我们的研究中测量出iDISCO是几种方法中缩小最明显的(平均缩小了30%)，组织也变得硬实，但是透明效果的稳定性很好，组间差异无显著性。而水基型透明法中是基于水环境中透明的，因此组织会出现不同程度的膨胀，其中水凝胶嵌入法的组织膨胀较为明显，由于CUBIC法改进使用两步法来透明组织，中间有一步PBS目的便是为了减少组织的膨大，第二步透明使用了高浓度的蔗糖，脱水的同时加速透明进程。因此CLARITY-CUBIC法膨胀率较Passive-CLARITY法明显减少(P< 0.01)。

在本次研究中，最优良的透明效果为CUBIC，虽然用时较长，但是效果稳定，组织变形小，试剂毒性小，也容易配制。而iDISCO也不失为备用的方法。

透明组织只是透明化成像技术的第一步，整个技术还需要探讨以下问题：(1)适用于带荧光蛋白标签的脑组织或者免疫荧光染色的方法。根据现有的研究，溶剂型透明3DISCO与iDISCO的报道是荧光会在几天内淬灭[16]。水基型中简单沉浸法(如SeeDB)最大的优点是保持各种组织的荧光的兼容性，包括了脂性标记染料如神经示踪剂Dil等。水化法中有报道Scale A2 及CUBIC溶液中含有高浓度的尿素及Triton用于去脂和洗涤，这过程会导致蛋白质大量降解(24%～41%)和降低荧光水平[4]。水凝胶嵌入法通过应用水凝胶替代细胞骨架结构，充分与组织细胞组分，包括蛋白质、神经递质、DNA等生物信息物质结合，因此在后续的荧光标记应用中更具优势。(2)透明化技术可应用的组织类别。目前透明化技术主要应用在神经系统中，有报道水凝胶CLARITY法可以应用在小鼠外周胃、小肠、心、肺、肾甚至肿瘤组织等，另外，在一些研究中可能需要对肌肉、骨头、脑组织等结构的联合观察，这些可应用动物全身透明化的方法值得深入探讨。(3)图像的捕捉，也是很关键的因素，目前有共聚焦、双光子显微镜和光层扫显微镜(light-sheet microscope LSFM)[17-20]，主要是物镜的工作距离和时间、扫描深度等技术问题影响成像深度和体积，目前来说，LSFM成像是透明化组织最理想的拍摄工具。(4)折光率匹配问题，原理上主要是球面光行差造成的成像减少，原因是物镜与组织内各种折光率不匹配[21]。(5)透明液的获取及处理，如iDISCO法很多试剂是有毒的，也可以溶解物镜的胶聚合物，弃液需要严格按照当地健康和安全法规执行毫无疑问，不久的将来，将会发明和改进更多的透明化和成像的方法，随着这些技术的发展，商业化试剂也会更加稳定高效，适用于各种物镜和显微镜。另外也会促进新的适用于透明化的抗体、荧光蛋白保护剂、RIMs等大规模的应用，使得透明化成像技术成为形态学研究的一个必备的方法。

通过本次比较实验我们可知，除SeeDB外，iDISCO法、CUBIC法、SCALEVIEW-A2法、CLARITY-CUBIC法、passive CLARITY法均能达到透明效果，CUBIC方法在大鼠脑组织块的透明效果优于其他各组，用时也相对适中，iDISCO处理后面积缩小较为明显，透明效果次之，但时间最短，可作为备选方案。其余的，SCALEVIEW-A2虽然步骤最简单，但效果欠佳，CLARITY-CUBIC和passive-CLARITY法均使用水凝胶，对脑组织中部的观察影响不大，如果研究关注的正好是边缘部位，此时因有水凝胶的残留，可能会影响观察，同时，Passive-CLARITY经过长期处理后膨胀最为明显。本研究初步探讨了各种透明法的效果和特征，为后续的光透明化三维成像提供了一些实践经验，因此，仍有必要进一步比较探讨不同透明化方法的适用范围和成像效果。

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