干扰E2F3基因对前列腺癌细胞侵袭、迁移的影响

蒋昱枫，张 炜，李 航，张 璐

(苏州大学附属第一医院泌尿外科，江苏 苏州 215006)

前列腺癌是一种发生于男性泌尿系统的恶性肿瘤，在欧美国家男性的发病率和死亡率较高。据统计，前列腺癌的发病率和死亡率居欧美国家男性患者的第1位和第2位[1]。近年来，随着老龄化问题的出现和人们生活方式的改变，我国前列腺癌的发病率逐渐上升[2-3]，严重威胁着男性的生命健康。研究表明，未发生转移的前列腺癌患者的5年生存率可达到100%左右，但已发生远处转移的患者5年生存率仅为28%[4]。研究表明前列腺癌侵袭、迁移的过程受到多种癌基因的调控，但其具体的作用机制还不完全清楚。E2F转录因子家族包括8个成员(E2F1-8)，可活化早期区域2(E2)启动子，通过调控细胞周期参与细胞的生长、分化过程。核转录因子E2F3是E2F家族的成员之一，参与细胞生长、分化等过程，从而调控肿瘤的发生、发展[5]。但在前列腺癌中关于E2F3的研究较少，因此本实验通过研究干扰E2F3基因表达对前列腺癌Du145细胞侵袭、迁移的影响及其可能的作用机制，以期为前列腺癌的治疗提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料

人前列腺癌细胞系Du145购自美国ATCC公司。

1.2 主要试剂

RPMI-1640培养基购自美国Gibco公司；胎牛血清、青霉素、链霉素购自美国HyClone公司；胰蛋白酶购自上海谱振生物科技有限公司；LipofectamineTM2000转染试剂、Transwell小室购自美国Millipore公司；siRNA-NC或siRNA-E2F3购自上海吉玛有限公司；E2F3抗体、钙黏蛋白E(E-cadherin)抗体、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloprotease-9, MMP-9)抗体购自美国Epitomics公司；β肌动蛋白(β-actin)抗体、HRP标记羊抗兔二抗购自美国Abcam公司。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞的培养

前列腺癌细胞Du145置于RPMI-1640培养基培养，加入10%的胎牛血清、青霉素和链霉素，确保细胞培养过程的无菌性，在5%CO2、37℃培养箱中培养过夜。每天观察细胞的生长状态，取生长状态良好的细胞用于后续实验。

1.3.2 转染细胞

转染前24 h，取对数期Du145细胞接种于24孔板上，每孔1×105个细胞，培养于细胞培养箱中，待细胞密度达到90%～95%左右进行转染。弃去完全培养基，加入400 μL Opti-MEM培养基。0.8 μg siRNA-NC或siRNA-E2F3与50 μL LipofectamineTM2000混合均匀，37℃结合20 min，将形成的siRNA-E2F3-LipofectamineTM2000复合物加入24孔板中，培养6～8 h，将培养基更换为完全培养基，细胞培养箱中培养48 h进行其它实验。实验分为对照组，Du145 NC组，Du145-siRNA组，蛋白质印迹法(western blot)检测转染效率。

1.3.3 细胞划痕实验检测细胞的迁移能力

取8×105个生长状态良好的对数期细胞接种到6孔板中，37℃培养箱中培养至细胞密度达到90%左右，200 μL消毒枪头划线，弃去液体，更换为不含血清的培养基，ImageJ 1.48软件观察细胞0、48 h的划痕距离，根据0、48 h划痕距离计算细胞的划痕愈合率，实验重复3次。

1.3.4 Transwell侵袭实验检测细胞的侵袭能力

实验前，稀释Matrigel胶，每1 cm2Transwell小室加入200 μL Matrigel胶，37℃通风30 min备用。细胞饥饿处理24 h，0.25%胰酶消化，离心，不含血清的培养基重悬细胞，以每孔5×105个细胞接种到Transwell小室上室中，下室中加入500 μL含10% 胎牛血清的培养基(作为趋化因子)，37℃培养箱继续孵育24 h，棉签擦去小室中未穿过滤膜的细胞，1%甲醇固定，苏木精染色，随机选取5个视野计算细胞的数量，每组5个复孔，取平均值代表侵袭数目。

1.3.5 Western Blot检测E-cadherin、MMP-9蛋白的表达

离心，收集细胞，PBS缓冲液清洗2次，加入200 μL RIPA细胞裂解液，在冰上冷却30 min，12 000 r/min离心20 min，取上清至一无菌的Ep管中，按BAC试剂说明书进行蛋白质定量。取100 μL蛋白提取液加入5 μL溴酚蓝混合均匀，置于沸水中煮沸10 min。配置10%的分离胶和5%的积层胶，加入20 μg样品蛋白，70 V电泳直至蛋白质进入积层胶，将电压调整至100 V，电泳至溴酚蓝到分离胶底部。切除多余凝胶，在转移盒中将蛋白质转移至甲醇浸泡的PVDF膜上。将带有目的条带的PVDF膜置于 5%脱脂牛奶封闭1～1.5 h，弃去封闭液。加入一抗，4℃孵育过夜，加入25 mL TBST清洗3次，每次10 min，加入二抗，室温下结合45 min，加入25 mL TBST清洗3次，每次15 min。加入化学发光剂，反应1 min，暗室中曝光1 min，以β-actin为内参，凝胶成像仪扫描蛋白质的灰度值。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 转染后细胞中E2F3蛋白的表达量

结果如图1、表1所示，转染siRNA-E2F3后，前列腺癌Du145细胞中E2F3蛋白的表达水平较对照组明显下降(t=7.526，P< 0.01)，Du145 NC组细胞中E2F3蛋白的表达量差异无显著性(P> 0.05)。

图1 转染后细胞中E2F3蛋白的表达量Fig.1 Expression of E2F3 protein in the transfected cells

组别GroupsE2F3蛋白相对表达量RelativeexpressionofE2F3protein对照组Controlgroup0.652±0.083Du145NC组Du145NCgroup0.587±0.064Du145-siRNA组Du145-siRNAgroup0.243±0.048*F32.716P0.001

注：与对照组相比，*P< 0.01。

Note.Compared with the control group，*P< 0.01.

2.2 干扰E2F3基因表达对细胞迁移能力的影响

结果如表2所示，Du145-siRNA组细胞划痕愈合率较对照组明显下降(t=5.335，P< 0.01)；与对照组相比，Du145 NC组细胞划痕愈合率差异无显著性(P> 0.05)。说明沉默E2F3表达后降低了前列腺癌细胞的迁移能力。

2.3 干扰E2F3基因表达对细胞侵袭能力的影响

结果如表3所示，Du145-siRNA组细胞侵袭数目显著低于对照组(t=4.133,P< 0.01)；Du145 NC组细胞侵袭数目较对照组差异无显著性(P> 0.05)。说明沉默E2F3表达后降低了前列腺癌细胞的侵袭能力。

表2 干扰E2F3基因表达对细胞迁移能力的影响Tab.2 Effect of interference of E2F3 gene expression on the cell migration ability

注：与对照组相比，*P< 0.01。

Note.Compared with the control group，*P< 0.01.

表3 干扰E2F3基因表达对细胞侵袭能力的影响Tab.3 Effect of interference of E2F3 gene expression on the cell invasiveness

注：与对照组相比，*P< 0.01。

Note.Compared with the control group，*P< 0.01.

2.4 干扰E2F3基因表达对细胞E-cadherin、MMP-9蛋白的表达的影响

结果如表4、图2所示，与对照组相比，Du145-siRNA组细胞中E-cadherin蛋白的表达量显著升高(t=9.887，P< 0.01)，MMP-9蛋白的表达量显著下降(t=8.362，P< 0.01)；对照组和Du145 NC组中E-cadherin、MMP-9的表达无显著性差异(P> 0.05)。

图2 干扰E2F3基因表达对细胞E-cadherin、MMP-9蛋白的表达的影响Fig.2 Effect of interference of E2F3 gene expression on the expression of E-cadherin and MMP-9 proteins in the cells

表4 干扰E2F3基因表达对细胞E-cadherin、MMP-9蛋白的表达的影响Tab.4 Effect of interference of E2F3 gene expression on the expression of E-cadherin and MMP-9 proteins in the cells

注：与对照组相比，*P< 0.01。

Note.Compared with the control group，*P< 0.01.

3 讨论

前列腺癌是一种男性常见的恶性肿瘤，在美国、欧洲等国家的发病率较高[6]。前列腺癌发生与多种因素相关，比如饮食习惯的改变、年龄的增长均可诱发前列腺癌[7]。目前，前列腺癌常用的治疗方式有内分泌治疗、手术、放化疗等[8]。但大部分前列腺癌发现时已是晚期，发生了远处转移，丧失了内分泌治疗、手术等根治性治疗的机会[9]。化学药物治疗易产生耐药性，放射治疗易产生毒副作用，因此寻找抑制前列腺癌侵袭和转移的治疗靶点具有重要意义。E2F3在前列腺癌组织中的表达量高于良性前列腺组织，其表达量随着临床分期和病理恶性程度的进展而逐渐升高，提示E2F3基因参与前列腺癌的发生、发展，其表达量增加表明肿瘤的恶性程度和侵袭、迁移性较高[10]。本研究通过siRNA技术沉默前列腺癌细胞中E2F3的表达；细胞划痕和Transwell小室侵袭实验表明，干扰E2F3基因表达后，Du145细胞的侵袭、迁移能力显著降低。因此，在前列腺癌的分子靶向治疗中，E2F3可作为一个重要的基因靶点。

E-cadherin是钙粘素家族的成员之一，不仅维持细胞间的物理性连接，还对上皮细胞特性的保持具有重要作用[11]。E-cadherin丢失使上皮细胞间的极性和粘附能力丢失，呈现非上皮细胞的特性。E-cadherin的表达量降低，会使细胞间的粘附能力降低，细胞易发生脱落[12]。研究表明E-cadherin的表达量与多种肿瘤的分化程度呈现正相关，参与肿瘤的侵袭、迁移过程[13-15]。基质金属蛋白酶(matrix metalloprotease, MMPs)是一类锌依赖性内切酶，可促进细胞外基质和基底膜的降解，其表达量上调可增强多种癌细胞的侵袭、迁移能力[16]。MMP-9是MMPs家族的重要成员，有研究认为MMP-9与肿瘤的侵袭、迁移能力关系最密切和直接[17]。既往研究表明MMP-9的表达量与前列腺癌病理学分级和临床分期具有相关性，参与前列腺癌的侵袭和转移过程[18-19]。本研究结果表明，干预E2F3表达可下调前列腺癌细胞中MMP-9蛋白的表达水平，上调E-cadherin蛋白的表达水平。提示干预E2F3表达可能通过降低MMP-9表达，增加E-cadherin表达而降低前列腺癌Du145细胞的侵袭、迁移能力。

综上所述，干预E2F3表达可能通过调控MMP-9蛋白和E-cadherin蛋白表达参与前列腺癌细胞的侵袭、迁移过程， 提示 E2F3可作为治疗前列腺癌转移的分子靶点。

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