心房钠尿肽对基因敲除小鼠移植黑色素瘤生长的抑制作用

亓翠玲，曹静桦，何亚军，李梦诗，李倩明，杨 扬，王丽京

(广东药科大学，基础学院血管生物学研究所，广州 510006)

心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide, ANP)是De Bold等[1]于1981年首次在心房肌细胞中发现的，是钠尿肽家族(NPs)被发现的第一个成员。之后发现了其他的成员，即脑钠肽(BNP)[2]、C-型钠尿肽(CNP)[3]和树眼镜蛇性钠尿肽(DNP)[4]。ANP与细胞膜上的受体鸟苷酸环化酶相互作用，发挥了重要的生物学功能。ANP最主要的生物学作用是排钠利尿，调节血压及参与水盐平衡等。研究表明ANP还具有其他生物学功能，如通过减少自由基的生成和抵制氧化应激反应，从而起到保护心肌的作用；通过重塑心肌结构，从而改善心力衰竭的症状；还可通过对子宫血管重塑，对生殖等发挥重要作用。但是，ANP对黑色素瘤生长的作用未见报道。作者利用C57BL/6J背景的ANP敲除小鼠建立黑色素瘤皮下移植瘤模型，研究ANP对黑色素瘤生长的作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级ANP杂合子小鼠(ANP+/-)，雄性2只，雌性6只，6～8周龄，体重18～20 g，由耿建国教授提供。C57BL/6J小鼠，SPF级，雌性，10只，6～8周龄，体重18～20 g，购自广东省医学实验动物中心[SCXK(粤)2008-0002]。小鼠饲养于广东药科大学实验动物中心，动物实验操作也在此进行[SYXK(粤)2012-0125]，并严格按照广东药科大学动物伦理要求进行动物实验(福利伦理审查证号：gdpulac2015014)。

1.2 主要试剂与仪器

B16F10黑色素瘤细胞株购于中国科学院上海生命科学研究院细胞库，常规培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液中；Rabbit anti-mouse Ki67抗体及rabbit anti-mouse CD31抗体购自博士德生物工程有限公司；Mouse anti-rabbit IgG购自北京中杉金桥生物有限公司。

主要仪器有PCR仪(美国应用生物系统公司)；光学显微镜及照相系统(日本Olympus公司)；全自动生物组织包埋机(PR公司)；烤片机(PR公司)；石蜡切片机和冰冻切片机(德国徕卡仪器公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 ANP纯合子敲除小鼠的建立

ANP纯合子敲除小鼠由ANP杂合子小鼠相互配种构建所得。本实验针对ANP基因设计了引物：引物1∶5′- CCT TCT ATC GCC TTC TTG ACG -3′；引物2∶5′- CTG TCC AAC ACA GAT CTG ATG -3′；引物3∶5′- CTG TTG CAG CCT AGT CCA CT -3′。反应条件为: 94℃预变性3 min, 94℃ 30 s, 64℃ 1 s, 72℃ 1 s; 35个循环；72℃充分延伸2 min。扩增产物为700 bp。

1.3.2 皮下移植瘤模型的建立

以C57BL/6J小鼠作为对照组，ANP敲除小鼠为实验组。对数生长期的黑色素瘤B16F10细胞，用胰酶消化离心后，用无菌的PBS重悬细胞。用台盼蓝对细胞进行染色以确定死细胞数低于5%后，在小鼠的右上肢腋下皮下接种0.2 mL的黑色素瘤细胞(1×105个细胞)。在接种后第7天每天用游标卡尺测量移植瘤的最大径(a)和最小径(b)，移植瘤体积的计算公式为：0.52×ab2。在肿瘤细胞接种12 d时，处死小鼠，分离小鼠肿瘤组织，并称重。

1.3.3 免疫组织化学染色

将小鼠的肿瘤组织石蜡包埋、切片后进行免疫组织化学染色。切片脱蜡、水化后，放于3% H2O2-甲醇液中，37℃浸泡30 min以消除内源性过氧化酶。PBS清洗3次后，高压修复10 min。血清封闭50 min后，加 rabbit anti-mouse Ki67抗体或 rabbit anti-mouse CD31抗体，4℃过夜。PBS清洗3次后，加二抗，37℃孵育50 min。PBS清洗3次后，DAB染色，苏木素复染后，常规脱水、透明、封片。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 ANP敲除小鼠的鉴定与扩群

本实验所有小鼠均为ANP杂合子小鼠(ANP+/-)，用雄性ANP+/-小鼠与雌性ANP+/-小鼠杂交，子代有杂合子、纯合子和野生型三种基因型小鼠。1、2、4和6号小鼠的电泳条带大小为700 bp，为纯合子小鼠；3号和5号小鼠电泳条带大小为700 bp和434 bp，为杂合子小鼠。接着，用ANP-/-小鼠与ANP-/-小鼠配种，对ANP-/-小鼠扩群。

注：3号和5号小鼠条带分别为700 bp和434 bp，为ANP杂合子小鼠，1号、2号、4号及6号小鼠的条带为700 bp，为ANP敲除纯合子小鼠。M：Marker 2000 bp；ANP-/-小鼠有一条带为700 bp；ANP+/-小鼠有两条带，分别为700 bp和434 bp，野生型小鼠有一条带为434 bp。图1 ANP基因的鉴定图Note.Lane 3,5: ANP+/- mice; Lane1, 2，4，6: ANP-/- mice.Fig.1 Identification image of ANP gene

2.2 ANP敲除抑制了黑色素移植瘤的生长

在ANP敲除小鼠和C57BL/6J小鼠皮下接种黑色素瘤B16F10细胞建立黑色素移植瘤模型，7 d后均形成明显的肿瘤结节。成瘤后，每天测量肿瘤的长径和短径，计算小鼠的肿瘤体积，发现在对应的时间内ANP敲除小鼠的肿瘤体积明显比C57BL/6J小鼠的肿瘤体积小(见图2A)。在肿瘤接种12 d时，用断颈法处死小鼠，分离小鼠肿瘤组织并称重，发现ANP敲除小鼠的肿瘤重量明显比C57BL/6J小鼠的肿瘤重量轻(见图2B)。

注：与C57BL/6J小鼠比较，*P< 0.05，**P< 0.01。图2 ANP敲除对小鼠黑色素移植瘤的作用Note.Compared with the C57BL/6J mouse，*P< 0.05，**P< 0.01.Fig.2 The effect of ANP knockout on the transplanted melanoma in mice

2.3 ANP敲除对黑色素瘤肿瘤细胞增殖和肿瘤微血管密度的作用

小鼠肿瘤组织石蜡包埋、切片后，用Ki67及CD31抗体检测肿瘤组织中增殖的细胞及血管。对于增殖细胞的统计，每张切片在400倍光镜下拍照，每张切片随机记录4～5个视野，计数每个视野中阳性细胞数及全部细胞数，增殖指数为增殖细胞数占全部细胞数的比值。发现ANP敲除小鼠肿瘤组织中细胞增殖指数明显比C57BL/6J小鼠少(图3A)。关于微血管密度，每张切片在200倍光镜下拍照，每张切片随机记录4～5个视野，计数每个视野中血管的数目，发现ANP敲除小鼠肿瘤组织中微血管数目明显比对照组少(图3B)。

3 讨论

ANP是广泛分布于心脏血管系统、中枢神经系统、免疫系统及肾脏组织中由心肌细胞合成和分泌的激素。ANP主要与NPRA结合，激活G蛋白和鸟苷酸环化酶，进而促进细胞内环磷酸鸟苷的生成[5-8]，从而利钠利尿、舒张血管、降低血压、参与脂质代谢及调节免疫等[9-12]。近年研究表明ANP还对纤维化、心肌缺血再灌注损伤等具有重要作用[13-14]。但是，ANP对肿瘤生长的作用尚未见报道。

为了确定ANP对黑色素瘤的作用，本研究利用ANP敲除小鼠建立了黑色素瘤皮下移植模型。利用基因工程小鼠建立肿瘤移植瘤模型具有其它模型无法比拟的优势：可以在基因产物的作用完全消除的情况下，研究单个基因在动物体内对肿瘤的作用，更能模拟肿瘤在人类体内发生发展的过程。本实验所用的基因工程小鼠为ANP敲除小鼠，在ANP敲除小鼠体内ANP的功能完全缺失。利用ANP敲除小鼠及其对照C57BL/6J小鼠建立的黑色素瘤皮下移植瘤模型，每组小鼠的肿瘤成功率可达100%，而且肿瘤生长速度较一致，个体差异也较小，而且肿瘤长于体表，易于观察及测量肿瘤，可以客观地判断ANP对肿瘤生长的作用。

注：与C57BL/6J小鼠比较，**P< 0.01，***P< 0.01。图3 ANP缺失抑制了肿瘤细胞增殖和肿瘤血管形成(Bar=100 μm)Note.Compared with the C57BL/6J mouse，**P< 0.01，***P< 0.001.Fig.3 Deletion of ANP inhibits tumor cell proliferation and tumor angiogenesis in the mice.

本研究利用ANP敲除小鼠建立的黑色素瘤皮下移植瘤模型，发现ANP敲除显著抑制了黑色素瘤的生长。为了进一步确定ANP敲除抑制黑色素瘤的作用，我们用免疫组化检测了肿瘤组织中增殖的细胞及微血管密度，发现ANP敲除后显著抑制了肿瘤细胞的增殖及微血管的密度。所以，ANP敲除可能通过抑制肿瘤细胞的增殖及减少微血管的数目，从而抑制了黑色素皮下移植瘤的生长。

综上所述，ANP缺失显著抑制了黑色素瘤的生长，但其分子机制尚不清楚，需进一步研究。进一步探讨ANP与肿瘤发生、发展的关系，将对于理想的抗肿瘤治疗靶点及判断患者预后具有重要意义，而且为ANP作为治疗肿瘤患者的新型药物提供了重要依据。

参考文献：

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