胶原诱导Wistar和Lewis大鼠类风湿关节炎模型病理特点的比较

施佳君，陈方明，马全鑫，陈 诚，陈姣姣，郁 晨，陈民利

(浙江中医药大学比较医学研究所动物实验研究中心，杭州 310053)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性、炎症性、系统性的自身免疫性疾病，其主要的病理学特征为关节滑膜组织增生以及骨、软骨等结构进行性病变，最终导致关节畸形，功能丧失，严重影响人们的生活质量[1]。动物模型是研究RA发病机制和防治方法的重要环节。牛II型胶原诱导啮齿类动物形成胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis，CIA)为常用的RA模型，尤其在药效学评价研究中大鼠CIA模型使用最多，国际上大多使用Lewis大鼠造模[2-3]，而国内大多用Wistar大鼠造模[4-5]。我们在前期研究工作中虽也发现Lewis大鼠和Wistar大鼠在成模率和对胶原的敏感性上有差异，但这两种模型在病症表现和病理特点上的差异尚不清楚。为此，本研究对胶原诱导的Wistar和Lewis大鼠RA模型的病症病理特点进行了比较研究，为大鼠RA模型动物的选择应用提供参考。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级雄性Wistar大鼠与Lewis大鼠各16只，体重为(170±10)g，购自北京维通利华实验动物有限公司[SCXK(京)2012-0001]；饲养于浙江中医药大学动物实验研究中心屏障环境实验室[SYXK(浙)2013-0184]；环境温度(23±1)℃；相对湿度50%～65%；光照12 h明暗交替(早7:30～晚19:30)；噪音：<50 dB。大鼠饲养于IVC中，每笼3只饲养，自由饮食；试验期间，遵循3R原则给予实验动物人道主义关怀，福利伦理审查证号[ZSLL-2016-84]。

1.2 主要试剂及仪器

牛II型胶原(CII)(20021)购自Chondrex公司；弗氏完全佐剂(CFA)(F5881)、弗氏不完全佐剂(IFA)(F5506)、一抗VEGF(sc-7269)等购自Santa Cruz公司；IL-6(ab9324)、IL-10(ab33471)和IL-17(ab214588)等购自Abcam公司；二抗：PV-8000通用型二抗试剂盒(含DAB显色液)购自中杉金桥公司；HRP标记兔抗大鼠二抗(BA1058)购自BOSTER公司；TMB底物溶液(J644)购自Amresco公司；苏木色精(M0820)购自上海伯奥生物科技有限公司；曙红Y水溶(71014544)购自国药集团化学试剂有限公司。

YLS-7C足趾容积测量仪(山东济南益延科技有限公司)；电子数显游标卡尺(Exploit公司)；多功能酶标仪(赛默飞世尔科技公司)； PLX7000B高频C臂X射线系统(南京Perlove医疗设备公司)；ASP200S全自动脱水机(Leica公司)；AP280-2包埋机(Microm公司)；半自动切片机(Leica公司)；NanoZoomer数字切片扫描仪(滨松光子公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 免疫原的制备

4℃无菌条件下，将CII冻干粉溶解于0.05 mol/L乙酸溶液中，配制浓度为2 mg/mL，与等体积的CFA或IFA充分混匀乳化(即每1 mL含1 mg CII)，采用注射器双推20 min，现配现用。

1.3.2 动物分组与造模

取Lewis和Wistar大鼠各6只为Lewis正常对照组、Wistar正常对照组，其余各10只尾根部皮内注射CII和CFA的1∶1乳化混合液进行首次免疫，其中，Lewis大鼠每只注射0.3 mL，Wistar大鼠每只注射0.4 mL；第14天加强免疫，均注射CII和IFA的1∶1乳化混合液每只0.2 mL，建立Lewis-RA模型和Wistar-RA模型，即为Lewis-RA组和Wistar-RA组。每日观察各组的发病情况，每周测定各组大鼠足肿胀程度，每隔3周评估关节炎指数，并测定关节炎血清抗CII抗体效价，第12周时进行X射线检查和组织病理学观察。

1.3.3 一般情况观察

观察各组大鼠的行为活动、精神状态、发病等情况，并记录发病时间和发病数量计算发病率。

1.3.4 关节肿胀和变形情况观察

1.3.5 病理学观察

观察结束后，各组大鼠实施过量麻醉安死术，沿后肢正中纵行切开皮肤直至暴露出膝关节，从膝关节囊上缘向上1 cm处剪断下肢，分离剥除肌肉，迅速放入福尔马林固定。固定72 h后，关节置10%甲酸中脱钙4周，待针刺骨组织无阻力感时即为脱钙完成，进行常规的脱水包埋后切成4 μm的薄片，行苏木素-伊红(HE)染色观察其病理变化。

1.3.6 免疫学相关指标的测定

每隔3周，眼眶取血0.6 mL，3000 r/min离心10 min，取其上清，-80℃冰箱保存，用于检测血清中抗CII抗体效价。

采用免疫组化染色方法检测踝关节相关免疫因子的表达。蜡块切成4 μm的薄片，60℃烘烤2 h，脱蜡，水洗，经高压修复后用3%的过氧化氢溶液封闭10 min以阻断内源性过氧化物酶，然后滴加VEGF、IL-6、IL-10和IL-17抗体稀释液于4℃孵育过夜，经PBS冲洗后滴加二抗，37℃孵育1 h，DAB显色，苏木素复染，透明后封片。目标蛋白被标记为棕黄色。用NanoZoomer数字切片扫描仪扫描切片，并用图像软件截取20×的照片，用IPP6.0软件分析其阳性表达光密度(IOD)。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 一般观察情况

Lewis和Wistar大鼠的正常对照组均饮食正常，精神状态良好，动作敏捷，四肢有力。Wistar-RA组有8只大鼠在首次免疫后第10天出现活动减少，精神萎靡，毛发粗乱，轻微脱毛，足掌部肿胀明显，第21天肿胀达到高峰，随后肿胀缓慢消退并从第5周进入平缓期，其余2只未见足掌肿胀，Wistar-RA组的成模率为80%。Lewis-RA组10只大鼠均在首次免疫后第14天出现脚掌和踝关节肿胀，第24天肿胀达到高峰，随后肿胀消退，第8周进入平缓期，Lewis-RA组的成模率为100%，且脚趾和关节变形严重，尾部有结痂。由表1可见，第3周、6周、9周、12周时Wistar-RA组和Lewis-RA组关节炎指数均显著升高(P< 0.01)，第6周后Lewis-RA组关节炎指数均高于Wistar-RA组(P< 0.05)，且随时间的延长，个体差异减少。

2.2 足容积和足掌厚度

由图1显示，与Lewis正常对照组比较，Lewis-RA组首次免疫后第2周至12周足容积、足掌厚度和足容积增长率、足掌厚度增长率均显著增加(P< 0.01)，足容积曲线和足容积增长率曲线在第3周达到高峰，随后曲线逐渐下降，第8周后曲线变平；足掌厚度曲线和足掌厚度增长率曲线也在第3周达到高峰，随后曲线下降，在第7周后曲线变平。而图2显示，与Wistar正常对照组比较，Wistar-RA组第2周至12周足容积、足掌厚度和足容积增长率、足掌厚度增长率均显著增加(P< 0.01)，且足容积曲线、足掌厚度曲线和足容积增长率曲线、足掌厚度增长率曲线均在第3周达到高峰，在第5周后曲线变平。

2.3 血清抗CII抗体效价水平

由图3可见，与正常对照组比较，Wistar-RA组和Lewis-RA组血清抗CII抗体效价均显著升高(P< 0.01)；与Wistar-RA组比较，首次免疫后6周、9周和12周时Lewis-RA组血清抗CII抗体效价均明显低于Wistar-RA组大鼠(P< 0.01)。

表1 Wistar和Lewis大鼠RA模型关节炎指数(AI)评分比较Tab.1 Comparison of arthritis indexes (AI) between the Wistar and Lewis rat RA models

注：与正常对照组比较，#P<0.05，##P<0.01；与Wistar-RA组比较，*P<0.05，**P<0.01。

Note.Compared with the control group，#P<0.05，##P<0.01.Compared with the Wistar-RA group，*P<0.05，**P<0.01.

图1 Lewis大鼠足容积和足掌厚度Fig.1 The paw volume and paw thickness of the Lewis rats

图2 Wistar大鼠足容积和足掌厚度Fig.2 The paw volume and paw thickness of the Wistar rats

注：与正常对照组比较，#P<0.05，##P<0.01；与Wistar-RA组比较，*P< 0.05，**P< 0.01。图3 血清抗CII效价抗体水平Note.Compared with the control group，#P<0.05，##P<0.01；Compared with the Wistar-RA group，*P< 0.05，**P< 0.01.Fig.3 Serum anti-CII antibody titers in the rats

2.4 后肢足关节形态和骨密度

由图4后肢X光片检查结果显示，Lewis和Wistar大鼠的正常对照组关节结构完整清楚，足趾各关节空隙清晰，均未见踝关节软组织肿胀。Lewis-RA组和Wistar-RA组均出现踝关节软组织肿胀，足趾各关节空隙狭窄且模糊，关节变形等病变。与Wistar-RA组比较，Lewis-RA组的足趾关节肿胀和骨质损伤更严重。图5X光片的骨密度分析结果显示，与正常对照组相比Lewis-RA组和Wistar-RA组股骨和胫骨骨密度均明显降低(P< 0.01)，但两模型组之间差异无显著性(P>0.05)。

注：A：Wistar正常对照组；B：Wistar-RA组；C：Lewis正常对照组；D：Lewis-RA组；“→”表示肿胀变形严重。图4 后肢足关节形态Note.A：Wistar control group.B：Wistar-RA group.C：Lewis control group.D：Lewis-RA group.“→” indicates serious swelling and deformation.Fig.4 Radiological images of the rat hind limb joints

注：与正常对照组比较，#P<0.05，##P<0.01；与Wistar-RA组比较，*P<0.05，**P<0.01。图5 后肢骨密度分析Note.Compared with the control group，#P<0.05，##P<0.01.Compared with the Wistar-RA group，*P< 0.05，**P< 0.01.Fig.5 Analysis of the bone mineral density of the rat hind limbs

2.5 踝关节常规病理组织学观察

HE染色结果显示，Lewis和Wistar正常对照组大鼠踝关节结构清晰，脂肪性滑膜和纤维性滑膜未见明显增生，软骨完整，未见炎症细胞浸润。两模型均出现软骨侵蚀，滑膜增生，大量炎症细胞浸润，破骨细胞增多，侵蚀、溶解全层骨组织，并有血管翳形成。与Wistar-RA组比较，Lewis-RA组软骨层破坏更严重、血管翳形成更多(图6)。

2.6 关节滑膜细胞因子的表达

免疫组化显示，与Wistar和Lewis大鼠的正常对照组比较，Wistar-RA组和Lewis-RA组大鼠踝关节滑膜中VEGF、IL-6、IL-17A的表达显著增加(P< 0.05，P< 0.01)，IL-10表达明显降低(P< 0.01)。与Wistar-RA组比较，Lewis-RA组VEGF表达显著高于Wistar-RA组(P< 0.05)，IL-17A则显著低于Wistar-RA组(P< 0.05)，而IL-6、IL-10的表达则无明显差异(P>0.05)(图7、图8)。

3 讨论

牛II型胶原(CII)诱导大鼠RA模型中，常用造模的首次免疫剂量为每只0.2～0.4 mg[7-8]，加强免疫剂量为每只0.2 mg，其中，Lewis大鼠造模的首次免疫剂量以每只0.2 mg或0.4 mg居多[9-10]，而Wistar大鼠造模的首次免疫剂量以每只0.4 mg居多[5,11]。我们前期研究曾在Lewis大鼠造模中使用CII首次免疫注射剂量每只0.4 mg，发现免疫后注射部位尾根部出现溃烂断裂。本实验中，将Lewis大鼠造模的CII首次免疫剂量改为每只0.3 mg，虽也出现尾部有结痂，但未见尾根部溃烂断裂；Lewis大鼠首次免疫后第14天出现肿胀，第24天达到高峰，随后肿胀逐渐消退，第7周进入平缓期，其成模率为100%，与文献描述一致[12]；Wistar大鼠造模使用CII的首次免疫剂量为每只0.4 mg，首次免疫后分别在第10天出现肿胀，第21天达到高峰，随后肿胀消退，第5周进入平缓期，成模率80%。足容积、足掌厚度测定结果也发现，Wistar-RA组和Lewis-RA组足容积、足掌厚度均在第3周达到高峰，随后逐渐下降，Wistar-RA组的足容积、足掌厚度在第5周后稳定在一定程度，而Lewis-RA组足容积、足掌厚度分别在第8周和第7周后稳定在一定程度，与Wistar-RA组比，Lewis-RA组的关节肿胀持续时间长2～3周。说明CII诱导后，Wistar大鼠肿胀出现快，但消退也快，肿胀的持续时间较短；而Lewis大鼠肿胀出现慢，但消退更慢，肿胀的持续时间长。且AI评分结果显示，Lewis-RA组AI第6周后明显高于Wistar-RA组，说明Lewis-RA组的关节损伤程度大于Wistar-RA组，这可能与Lewis-RA的关节肿胀的持续时间有关。

注：与正常对照组比较，#P<0.05，##P<0.01；与Wistar-RA组比较，*P<0.05，**P<0.01。图7 关节滑膜VEGF、IL-6、IL-10、IL-17A的表达Note.Compared with the control group，#P<0.05，##P<0.01.Compared with the Wistar-RA group，*P<0.05，**P<0.01.Fig.7 Expression of VEGF, IL-6, IL-10, IL-17A in the synovial tissues

图8 踝关节VEGF、IL-6、IL-17A、IL-10免疫组化结果(Bar=250 μm)Fig.8 Expression of VEGF, IL-6, IL-17A and IL-10 in the ankle tissues. Immunohistochemical staining

类风湿关节炎会导致关节软骨、骨组织结构破坏以及功能障碍，也是继发骨质疏松的重要原因[13]。后肢X光片检查结果发现，Lewis-RA组和Wistar-RA组均出现踝关节软组织肿胀，足趾各关节空隙狭窄且模糊，关节变形等病变。但Lewis-RA组的足趾关节肿胀和骨质损伤更严重。且对X光片的骨密度分析结果发现，Lewis-RA组和Wistar-RA组股骨和胫骨骨密度均明显降低(P< 0.01)，说明Lewis-RA和Wistar-RA已出现了骨质疏松的症状。组织病理学观察发现，Wistar-RA组和Lewis-RA组大鼠踝关节均出现了滑膜增生、血管翳形成，软骨破坏和骨侵蚀等典型的RA症状，且Lewis-RA组大鼠的软骨破坏更严重，血管新生和滑膜血管翳形成更多，这说明Lewis大鼠的关节损伤更为严重。

CII抗体免疫应答与RA关节的系统性受累以及持续的慢性发展有着紧密联系。本实验结果显示Lewis-RA组大鼠的血清抗CII抗体效价低于Wistar-RA组大鼠，这可能与Lewis大鼠CII的首次免疫剂量低于Wistar大鼠有关。然而从发病率来看，X光片和组织病理学观察结果表明Lewis大鼠的关节损伤更严重，这可能与Lewis大鼠自身遗传的生理特性有关。Lewis大鼠先天的下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA)轴功能低下[14-15]，免疫亢进，易感类风湿关节炎和实验性脑脊髓炎等自身免疫性疾病[16]，说明Lewis大鼠更易诱导形成类风湿关节炎模型。

慢性炎症反应是RA的主要发病机制，淋巴细胞浸润及其分泌促炎因子和抗炎因子之间的相互作用和调节，形成复杂的调控网络，控制着关节炎的发生和发展[17]。IL-17A是具有强大致炎作用的促炎细胞因子，能促进成纤维细胞分泌IL-6、IL-8、GM-CSF等炎症因子，并能刺激破骨细胞分化和活化，是导致滑膜炎症、骨破坏的重要因素[18-19]。IL-6在骨的新陈代谢中诱导破骨细胞前体分化成真正的破骨细胞，是进一步破坏骨和软骨的主要因素，IL-6水平与慢性滑膜炎的局部关节症状及关节破坏的严重程度密切相关[20]。IL-6可提高VEGF的水平，VEGF作为血管新生的重要诱导剂，对RA滑膜炎症和滑膜血管翳的形成具有重要作用[21]。IL-10是一种抗炎性因子，在类风湿关节炎的发病中起一定作用，中和IL-10后关节炎加重[22]。本实验结果显示，Wistar-RA组和Lewis-RA组踝关节滑膜中VEGF、IL-6、IL-17A的表达显著增加，而IL-10表达明显降低，表明在Wistar-RA模型和Lewis-RA模型的病理过程与VEGF、IL-6、IL-17A和IL-10的表达密切相关。实验结果还显示，Lewis-RA组关节滑膜IL-17A表达低于Wistar-RA组，而VEGF表达则高于Wistar-RA组，提示Wistar-RA模型中IL-17A的促炎作用更强，而Lewis-RA模型关节滑膜血管新生和血管翳形成更明显，可能是与VEGF的高表达有关。

RA是一种自身免疫性炎症性疾病，临床表现为关节肿胀、疼痛、变形，其病理是以滑膜持续炎症，骨骼破坏及软骨降解为特征[23]。炎症细胞因子激活破骨细胞是局部骨破坏的重要原因之一[24]。本实验通过CII诱导建立大鼠RA模型，均出现了关节肿胀、变形，活动减少等症状，关节炎指数升高，关节滑膜中VEGF、IL-6、IL-17A的表达增加，IL-10表达下降，与临床的症状表现和病理机制相符。但Wistar大鼠模型和Lewis大鼠模型的病程、病症和病理特点存在一定的差异。Wistar大鼠胶原诱导后肿胀出现快，但肿胀的持续时间较短；而Lewis大鼠胶原诱导后肿胀出现慢，但肿胀的持续时间长，Wistar大鼠造模价格便宜，但成模率低，而Lewis大鼠价格高，但成模率100%，且关节损伤更为严重、血管新生和血管翳形成更明显。因此，对这两种模型的选择需要根据其不同的病征特点以及实验目的综合考虑而定。

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