巴马小型猪胚胎-胎仔发育毒性试验基础数据的建立

张元慧，郝新彦，高 虹

(中国医学科学院医学实验动物研究所，北京协和医学院比较医学中心，北京 100021)

随着时代的发展，各类外源化合物如农药、兽药、化妆品、食品添加剂、环境污染物日益增多，长期接触这些化学物质可导致人类生殖细胞损伤，生育能力下降，胚胎死亡、畸形比例上升，这一问题促使各国加强了对生殖毒性评价的重视[1]。生殖毒性试验是研究有害因素对亲代生殖功能和子代生长发育造成的有害作用，是药物非临床安全性评价的重要组成部分[2]，其对实验动物种属的选择也越来越严格。随着人们对小型猪研究的逐渐深入，发现其性成熟时间为6个月，发情周期和妊娠期短，胎仔数量多，胚胎大，便于观察微小畸形[3]，与人类在解剖学、生理学、疾病发生机理等方面存在一定的相似性[4-5]，是潜在的生殖毒性评价的良好动物模型。因此，本研究对妊娠不同时期的巴马小型猪进行解剖，观察孕猪的生殖功能指标和胎仔的各项发育指标，为生殖毒性研究提供正常值的参考依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

自然受孕二胎妊娠巴马小型猪12只，体重50.8～119.5 kg，均接种猪瘟、口蹄疫、细小、乙脑、呼吸与繁殖综合征共5种疫苗，由北京实创世纪小型猪养殖基地提供[SCXK(京)2013-0008]。饲养于普通环境内，室温16℃～21℃，湿度60%～80%。常规饲养，饲养环境指标控制在国标规定的范围内。实验中涉及动物的操作程序已经得到中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会(IACUC)批准，批准号为ILAS-GH17001。

1.2 实验方法

1.2.1 孕猪处理

雌性巴马小型猪分别于妊娠第30、40、50、60、70、80、90、100、112天舒泰过量麻醉处死，检查孕猪外观是否异常，切开腹部暴露子宫和内脏器官，将子宫与母体分离，称量子宫重量，取出子宫内的胎仔，计数黄体数、着床数、活胎数、吸收胎数和死胎数。称量活胎的重量，测量活胎的身长、尾长、脑直径，每个胎仔均进行X光拍照。

1.2.2 胎仔检查

观察胎仔头部有无露脑、脑膜膨出，眼耳口鼻外观有无异常，上下颌有无唇裂，再进行四肢、躯干和尾部的检查，有无脐疝、腹裂，脊髓膨出、脊柱裂、脊柱侧突等，有无短尾、卷尾、无尾等异常情况。X光拍照后将每窝一半胎仔放入Bouin’s液中固定进行内脏检查，另一半胎仔用氢氧化钾茜素红染色进行骨骼检查[6]，其中妊娠112 d孕猪胎仔直接进行大体解剖检查。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 孕期小型猪生殖功能指标及胎仔生长发育指标

在胚胎-胎仔生殖毒性试验中，妊娠动物自身增强的毒性、胎仔生长发育及死亡情况均是该段试验评价的主要内容[7]。评价指标主要包括孕猪外观和各脏器发育情况，黄体数、活胎数、死胎数、吸收胎数和着床数，胎仔外观发育情况，胎仔的身长、尾长等数值。各项指标的数据见表1、表2。

表1 巴马小型猪孕期生殖功能指标Tab.1 Reproductive parameters of the pregnant Bama minipigs

表2 巴马小型猪胎仔生长发育指标Tab.2 Indexes of embryonic development of the Bama minipigs

注：(a)30 d胎仔；(b)40 d胎仔；(c)50 d胎仔；(d)60 d胎仔；(e)70 d胎仔；(f)80 d胎仔；(g)90 d胎仔；(h)100 d胎仔。图1 巴马小型猪胎仔外形Note.(a)A 30-day-old embryo.(b)A 40-day-old embryo.(c)A 50-day-old embryo.(d)A 60-day-old embryo.(e)A 70-day-old embryo.(f)A 80-day-old embryo.(g)A 90-day-old embryo.(h)A 100-day-old embryo.Fig.1 External appearance of Bama minipig embryos

胚胎龄(d)Embryonicages外形特征Externalfeatures30外耳出现,视网膜色素明显Aurisexternaformed,obviousretinalpigment40指(趾)分开,眼睑闭合,性别可辨Digitsseparated,catamysis,distinguishablegender50耳竖起Earrear60蹄甲出现Hoofandnailformed70头臀黑的毛色特点出现Theskinofheadandbuttockblackened80眉毛出现Eyebrowformed90牙齿出现Teethformed100外形特征发育良好Externalfeatureswelldeveloped112与成年猪的外观特点一致Consistencewiththeappearanceofadultminipigs

2.2 胎仔外观检查

妊娠30 d小型猪胎仔性别无法分辨，妊娠40 d胎仔外观即可分辨性别。外观形态如图1所示，外观检查结果如表3所示。

2.3 胎仔内脏检查

妊娠30 d的胎仔各内脏器官初步成型，但未发育完全，妊娠40 d胎仔各内脏器官已发育成型，可作为生殖毒性试验的观察对象。固定后胎仔形态如图2所示，内脏检查结果如表4所示。

2.4 胎仔骨骼检查

妊娠30 d的胎仔骨骼未发育完全，无法用X光和骨骼染色法进行观察。各胎仔骨骼发育情况如图3、表5所示。

2.5 胎仔发育情况

根据本次试验得到的数据结果，将巴马小型猪胎仔的发育特征总结如表6所示。

表4 巴马小型猪胎仔内脏发育特征Tab.4 Embryonic visceral developmental characteristics of the Bama minipigs

表5 巴马小型猪胎仔骨骼发育数量(块)Tab.5 Indexes of embryonic skeletal development of the Bama minipigs(Block)

注：(a)30 d胎仔；(b)40 d胎仔；(c)50 d胎仔；(d)60 d胎仔；(e)70 d胎仔；(f)80 d胎仔；(g)90 d胎仔；(h)100 d胎仔。图2 Bouin’s液固定后的巴马小型猪胎仔Note.(a)A 30-day-old embryo.(b)A 40-day-old embryo.(c)A 50-day-old embryo.(d)A 60-day-old embryo.(e)A 70-day-old embryo.(f)A 80-day-old embryo.(g)A 90-day-old embryo.(h)A 100-day-old embryo.Fig.2 Bouin’s fluid-fixed Bama minipig embryos

胚胎龄(d)Embryonicages发育特征Developmentalcharacteristics30内脏器官初步成型,但未发育完全,骨骼骨化不全Basicorgansformedinitially,butnotdevelopedwell40性别可辨,器官形成期结束,各内脏器官已发育成型,躯干骨和四肢骨均可进行肉眼观察Genderdistinguishable,thestructureofbasicorgansweregraduallycompleted50掌骨和跖骨发育完全Metacarpusandmetatarsuswellformed60蹄甲出现,器官组织结构逐渐成熟,后肢趾骨全部成型Hoofandnailformed,organsdevelopedwell,phalanxformed70除腕骨和部分跗骨等较小的骨骼未成型,其他骨骼均骨化完全Boneossificationiscompleted,exceptforcarpusandtarsus80尾椎发育更加完全Tailbonedevelopedwell90胸骨发育更加完全Sternumdevelopedwell100腕骨、跗骨全部成型Carpusandtarsusformed112内脏器官、骨骼系统发育完全Visceralandskeletalsystemdevelopedwell

3 讨论

生殖毒性是指有害因素对亲代生殖功能造成的有害作用[8]，其研究是受试物非临床安全性评价的重要内容，与急性毒性、长期毒性、遗传毒性等毒理学研究联系紧密。在传统的三段生殖毒性试验中[9]，即生育力与早期胚胎发育毒性试验(I段)、胚胎-胎仔发育毒性试验(II段)、围产期毒性试验(III段)，胚胎-胎仔发育毒性试验II段)是评价妊娠动物增强的毒性、胚胎胎仔死亡情况、生长改变和结构变化，此阶段妊娠动物接触有害外来物质将会给胎仔生长发育带来严重不良影响，因此选择合适的动物模型对结果的判断显得尤为重要。试验通常选择两种动物[10]，即啮齿类动物和非啮齿类动物，常规选用的是大鼠和家兔，但当大鼠或家兔等传统动物不适合进行致畸性试验研究时，也可采用小型猪作为替代动物[11]。

小型猪发育毒性试验一般选择在妊娠110～112 d左右处死进行剖宫检查[12]，但试验的周期过长，为了进一步缩短试验的期限，有研究者对哥廷根小型猪中期(妊娠第60天)和终末(妊娠第110天)剖宫产检查结果进行了比较分析，发现中期剖宫产胎猪生殖器官内部检查可确定性别，骨骼和软骨双染法可检出骨骼改变，从而表明小型猪中期剖宫产技术可行[13]。在小型猪胚胎发育过程中，妊娠第40天胚期结束，各脏器基本发育成型，并可分辨性别，因此本实验选择在妊娠第30、40、50、60、70、80、90、100、112天处死孕猪进行剖宫检查，并对妊娠不同天数的巴马小型猪胚胎的发育情况进行观察总结，发现妊娠40 d后的小型猪胎仔各内脏器官、骨骼系统已发育成型，可以作为胚胎-胎仔发育毒性试验的观察对象，且小型猪的自然畸变率相对较低，可成为生殖毒性试验的良好动物模型。此次研究得到这些基础数据可以为受试物的生殖毒性试验提供背景参考数据，随着研究的不断深入，将有更多的数据补充进去，使实验结果更加真实可靠。

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