三种小鼠RNA病毒样品储运条件对核酸检测的影响

李欣悦，佟 巍，张丽芳，阮研硕，丛日旭，向志光

(中国医学科学院医学实验动物研究所，北京 100021)

核酸检测在实验动物微生物质量控制中发挥着重要作用，它可以在实验动物感染早期检测到病原微生物核酸，还可以持续监测感染动物的排毒状态[1]。小鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus，MHV)和呼肠孤病毒III型(reovirus 3，Reo-3)是最主要的且是最常见的啮齿类动物感染病原体[2]，小鼠诺如病毒(murine norovirus，MNV)是实验小鼠感染率较高的病原体[3]。这三种病毒常呈隐性感染，一定条件下才会发病，严重影响实验动物健康和实验研究。因此对实验动物粪便或盲肠内容物进行病毒核酸检测是非常重要的。目前已建立实验动物病毒核酸检测方法，在实际应用中采样处理和样品检测步骤中间，需经过一段时间的运输和储存。但实验动物粪便或盲肠内容物复杂，样品的运输或保存不当可能会影响核酸提取质量，进而影响核酸检测结果，特别是RNA病毒。针对病毒特性和不同类型的样品的特点，应确定相应运输温度和核酸稳定剂的使用。RNA提取试剂的裂解液可抑制生物样品中的RNA酶，可以作为备选储存剂。而在样品运输时较为方便的条件为蓝冰运输，该运输温度可维持在0℃～8℃。本研究比较了MHV，Reo-3，MNV三种病毒参考品在裂解液和生理盐水中，在不同储存温度及时间等运输条件下病毒检出量的变化。

表1 引物和探针序列Tab.1 Primers and probe sequences

1 材料和方法

1.1 参考品的制备

MHV、Reo-3、MNV等病毒来源于the American Type Culture Collection (ATCC)，本室保存。小鼠盲肠内容物采自-送检至我实验室的SPF级C57BL/6J小鼠，动物实验在中国医学科学院医学实验动物研究所[SYXK(京)2014-002]进行，并获得本单位实验动物使用和管理委员会的批准(IACUC：XZG17001)。对盲肠内容物应用核酸检测方法排除了MHV、Reo-3、MNV及国家标准须排除的病原项目。将SPF级小鼠的盲肠内容物混合分为三组，按每0.1 g加入50 μL 50倍稀释的病毒原液，制成三种病毒的参考品，使参考品初始病毒核酸量在104～107copies/μL范围之间。

1.2 实验方法

1.2.1 样品分组及保存

将参考品按1∶4的比例加入 Buffer AVL，颠倒混匀10次，室温放置2 min后，按每管200 μL分装制成Buffer AVL 组样品，分别置于4℃冰箱(2℃～8℃)和室温(22℃～25℃)保存1、2、3、7、14 d。生理盐水(normal saline, NS)组样品以同样的方式处理。分别于各个时间点取两个平行样品置-80℃保存。

1.2.2 样品RNA提取

各时间点样品经12 000 r/min离心5 min后，取140 μL上清液，用QIAGEN公司病毒RNA提取试剂盒进行样品RNA提取。

1.2.3 探针法实时荧光定量 PCR方法检测

试剂采用Takara公司的One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit，引物和探针序列[4-5]见表1。用ABI 7500 Fast 实时PCR系统对各样品进行荧光PCR分析。以1×101～1×107copies/μL的稀释质粒样品制作标准曲线，计算各样品的病毒检出量。

1.2.4 实验环境

所有实验步骤均在生物安全二级(BSL-2)实验室内完成，其中病毒参考品的制备，样品分组以及样品RNA提取当中的裂解步骤均在A2型生物安全柜内操作。

2 结果

2.1 参考品初始病毒核酸量及其在real time PCR中的 CT值

本研究以参考品0 d时检测的病毒检出量为基值，计算并比较各时间点样品病毒检出量的变化。其中MHV 参考品0 d时CT值为19.31，病毒核酸量为2×106copies/μL。Reo-3参考品0 d时CT值为25.05，病毒核酸量为5×104copies/μL。MNV参考品0 d时CT值为16.30，病毒核酸量为2.5×105copies/μL。

2.2 保存剂对核酸样品检出量的影响

无论是4℃还是室温保存，生理盐水组的参考品2 d病毒检出量都在50%以下，远低于buffer AVL组。其中MHV生理盐水组1 d时已降低至15%；Reo-3生理盐水组1 d病毒检出量为73%，而2 d时已降低至7%，其下降幅度最为显著，如图1～6所示。因此，buffer AVL可以作为样品保存剂，具有延缓RNA降解的作用。

2.3 存储温度对样品检出量的影响

4℃ buffer AVL组MHV参考品在1、2、3、7 d病毒检出量分别降低了0%、16%、42%、76%，而室温组样品在1、2 d病毒检出量分别降低了14%、69%，如图1和图2所示；4℃ buffer AVL组Reo-3参考品1、2、3、7 d病毒量分别降低了3%、11%、17%、50%，而室温组样品在1、2 d病毒检出量分别降低了3%、40%，如图3和图4所示；4℃ buffer AVL组MNV参考品1、2、3、7 d病毒量分别降低了11%、16%、35%、60%，而室温组样品在1、2 d病毒检出量分别降低了49%、56%，如图5和图6所示。Buffer AVL组样品室温组样品的病毒检出量的下降幅度明显高于4℃组。

2.4 保藏时间对样品核酸检出量的影响

4℃ Buffer AVL组MHV、Reo-3、MNV三种病毒参考品在3 d时间点的病毒检出量在50%以上，分别为58%、83%、65%；在7 d时间点仍有检出，但已经降低至24%、50%、40%；在14 d时间点无检出，如图1、图3和图5所示。

图1 4℃保存盲肠内容物样品不同保存天数小鼠肝炎病毒核酸检出量变化Fig.1 Changes of the amount of MHV nucleic acid in cecal content samples stored at 4℃for different days

图2 室温保存盲肠内容物样品2 d内小鼠肝炎病毒核酸检出量变化Fig.2 Changes of the amount of MHV nucleic acid detected in cecal content samples stored at room temperature for 2 days

图3 4℃保存盲肠内容物样品不同保存天数的呼肠孤病毒III型核酸检出量变化Fig.3 Changes of the amount of Reo-3 nucleic acid detected in the cecal content samples stored at 4℃ for different days

图4 室温保存盲肠内容物样品不同保存天数的呼肠孤病毒III型核酸检出量变化Fig.4 Changes of the amount of Reo-3 nucleic acid detected in the cecal content samples stored at room temperature for 2 days

图5 4℃保存盲肠内容物样品不同保存天数的小鼠诺如病毒核酸检出量变化Fig.5 Changes of the amount of MNV nucleic acid detected in cecal content samples stored at 4℃ for different days

图6 室温保存盲肠内容物样品不同保存天数的小鼠诺如病毒核酸检出量变化Fig.6 Changes of the amount of MNV nucleic acid detected in the cecal content samples stored at room temperature for 2 days

3 讨论

3.1 实验动物粪便样品应使用具有抑制RNA酶活性的保存剂进行运输

实验动物样品从现场采集到样品检测之间存在一段运送过程。动物粪便样品以及盲肠内容物等样品成分复杂，含有大量的酶类，其中包括RNA酶。而这些样品中的病毒等检测的靶标为病毒的核酸，极易受到样品中RNA酶的影响而降解。因此需要尽早抑制样品中RNA酶的活性。本研究结果表明，选择使用RNA提取试剂中的裂解液为保存液，与生理盐水组相比，可以提高核酸检出率。究其原因，在于RNA提取试剂裂解液中的RNA酶抑制剂有效的抑制了内源性的RNA酶，对核酸样品进行了有效保护。

3.2 关于低温运输

4℃ Buffer AVL保存条件的三种病毒参考品的核酸量降低幅度小于室温条件，说明低温运输与有利于样品核酸的检测。使用干冰运输，储存温度接近-70℃，某种意义上对核酸样本的保护更有利。但干冰运输的成本较高。在本研究中使用蓝冰运输并结合使用RNA提取试剂中的裂解液作为保护剂，在3 d时间点的病毒检出量减少量在50%以内，我们认为MHV、Reo-3、MNV三种病毒盲肠内容物样品的核酸检测在3 d内完成，其检测结果较为可靠。因此，以RNA提取试剂中的裂解液为保护剂和蓝冰运输(0℃～8℃)即可基本满足此类核酸检测样品短途储运的需求，且可降低运输成本。

3.3 核酸定量检测方法的适用性

实验动物病原微生物核酸检测方法包括普通PCR以及实时荧光定量PCR等技术，其检测的目标为微生物的核酸分子。检测结果以检出或未检出进行描述，出具定性结果报告。本研究为了分析检出量的变化采用了实时荧光定量PCR的方法。针对三种消化道病原体建立的real-time PCR检测体系，其对低拷贝样品的检测下限达到10 copies/μL，(MHV 1×101copies/μL样品CT值35.61；Reo-3 1×101copies/μL样品CT值36.96；MNV 1×101copies/μL样品CT值31.05，结果未显示)，此类方法满足实验动物粪便样品的检测需求。

为了更好的测试保存和运输条件对于核酸样品的影响，本研究所使用的模拟样品的起始浓度为5×104～2×106copies/μL，检测的CT值为16.30至25.05，此样品浓度在real-time PCR检测方法的最佳检测范围内[6],在核酸样品浓度有限降低时(本研究中下降98%)仍可有效检测。通过MHV、MNV感染实验动物获得的阳性盲肠内容物和粪便样品，经real-time PCR检测样品CT值在20～28范围内[1, 7-8]，而本研究的模拟样品与实际样品相比其病原核酸浓度偏高，其目的在于展示储运条件对于核酸样品检测的影响。

实验动物携带其他病原体的样品对储运条件的敏感性亦可进行类似的测试。同时实验动物病原核酸的检测也应该考虑核酸扩增反应存在的其他干扰因素。

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