肉桂醛对呼吸道合胞病毒感染宿主HeLa细胞Caspase-9和p-AKT表达的影响

卫 高 代立娟 宋英杰

(佳木斯大学研究生部，黑龙江 佳木斯 154007)

呼吸道合胞病毒〔1,2〕感染后，若不及时处理易并发呼吸衰竭危及生命。而可选的抗病毒药物较少，且这些药物不仅过于广谱，有的不良反应明显。肉桂醛〔3〕是一种较好的抗病毒中药，有实验已证明它在凋亡通路上有较好的抗病毒作用〔4〕，但机制不清。本实验从促凋亡蛋白含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase-9)和抑凋亡蛋白磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)表达方面探讨其原理。

1 材料与方法

1.1材料 呼吸道合胞病毒，Hela细胞株由佳木斯大学基础医学实验室保存。肉桂醛、1640培养液、胎牛血清分别购买于美国Sigma 公司、Invitrogen 公司、浙江天杭生物科技股份有限公司。兔抗Caspase-9多克隆抗体北京百奥莱博科技有限公司，p-AKT蛋白多克隆抗体上海钰博生物科技有限公司。

1.2细胞培养 准备培养箱,其内温度为37℃、CO2浓度为5%。准备10%的细胞培养液，置于培养瓶中；把预备好的Hela 细胞接种到培养瓶中。将处理好的培养瓶(培养瓶1 d更换1次培养液)放到准备好的培养箱中,多次观察细胞生长，观察到细胞生长大于80%时停止,胰酶消化后进行传代培养，培养细胞到需要量停止。

1.3病毒液制备收集 细胞培养应当每日观察,当观察到细胞达70%后，接种准备好的呼吸道合胞病毒液，后继续培养,当发生病变到75%时，经过3冻3融(温度为-80℃，37℃)收集后，收集病毒液置于低温冰箱保存以备用。

1.4肉桂醛配制 准备2%细胞维持液稀释肉桂醛到需要浓度,准备滤器将其过滤以备用。

1.5接种病毒毒力测定 Hela细胞接种96孔板，待细胞长成单层，将已经稀释好的不同浓度的病毒液置于孔板中，每一个浓度重复8孔，后置于培养箱中培养，设阴性对照组和正常细胞组，显微镜多次观察细胞形态，根据细胞变性效果(CPE) 结果变化用Reed-Muench法计算细胞半数感染量(CCID50)，本实验中100CCID50/100 μl为病毒攻击量。直接灭活阶段、生物合成阶段、病毒吸附阶段、药物预处理作用，4个阶段均用这个病毒100CCID50/100 μl呼吸道合胞病毒液。

1.6肉桂醛对Hela细胞毒性测定

1.6.1对呼吸道合肥病毒的直接灭活作用 将Hela细胞接种至放有盖玻片经多聚赖氨酸处理的8孔板中，当其长成约70%备用，将低(0.007 810 mg/mg)、中(0.015 63 mg/mg)、高浓度(0.031 25 mg/mg)的肉桂醛与病毒液等量混匀，置37℃温箱2 h后，将其接种在Hela细胞已长成单层的96孔细胞培养板中，37℃下培养吸附2 h后，弃上清，加维持液，每一浓度设8个复孔，实验同时设病毒组、正常细胞组作为对照，置于5%CO2、37℃孵箱培养。每日多次观察CPE，Western印迹测定Caspase-9蛋白和p-AKT蛋白表达情况。

1.6.2对呼吸道合肥病毒的吸附作用 将Hela细胞接种至放有盖玻片经多聚赖氨酸处理的8孔板中长成约70%备用，将低(0.007 810 mg/mg)、中(0.015 63 mg/mg)、高浓度(0.031 25 mg/mg)的肉桂醛与病毒液等量混匀，弃8孔板中培养液。每孔加入不同浓度的肉桂醛与病毒的混合液，设病毒组、正常细胞组作为对照，置37℃温箱2 h，后弃混合液病毒液，加入2%细胞维持液，每日多次观察CPE，Western印迹测定Caspase-9蛋白和p-AKT蛋白表达情况,作记录。

1.6.3生物合成阶段 将Hela细胞接种至放有盖玻片经多聚赖氨酸处理的96孔板中长成约70%备用，将低(0.007 810 mg/mg )、中(0.015 63 mg/mg)、高浓度(0.031 25 mg/mg)的肉桂醛与病毒液等量混匀，置37℃温箱2 h。弃8孔板中培养液。每孔加入不同浓度肉桂醛与病毒的混合液，设病毒组、正常细胞组作为对照，置37℃温箱2 h，弃混合液病毒液，加入细胞维持液，每日多次观察CPE，Western印迹测定Caspase-9蛋白和p-AKT蛋白表达情况,作记录。

1.6.4对细胞的保护作用 将Hela细胞接种至放有盖玻片经多聚赖氨酸处理的96孔板中长成约70%备用，将低(0.007 810 mg/mg)、中(0.015 63 mg/mg)、高浓度(0.031 25 mg/mg)的肉桂醛与其等量混匀，置37℃温箱2 h。弃8孔板中培养液。每孔加入不同浓度的肉桂醛与病毒混合液，设病毒组、正常细胞组作为对照置37℃温箱2 h，弃混合液病毒液。每孔加入病毒液，每日多次观察CPE，Western印迹测定Caspase-9蛋白和p-AKT蛋白表达情况,作记录。

1.7统计学方法 采用SPSS18.0软件进行方差分析、LSD检验。

2 结 果

肉桂醛在0.078 10～0.031 25 mg/ml之间有效且无毒。一定范围内肉桂醛浓度降低呼吸道合肥病毒毒性。呼吸道合胞病毒毒力在病毒组细胞病变达到75%时，电镜下观察，细胞形态学变化大于50%即CPE 阳性。用Reed-Muench法计算得CCID50为106.65，本实验中100CCID50/100 μl 病毒攻击量为104.65。与正常细胞组相比，病毒组Caspase-9蛋白表达明显升高、p-AKT蛋白表达明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)。经药物干预后与病毒组相比，细胞Caspase-9蛋白表达明显下降，且高浓度组下降最多，其次为中浓度，低浓度下降最少(均P<0.01)。细胞p-AKT蛋白表达明显增加，且高浓度组增加最多，其次为中浓度，低浓度增加最少(均P<0.01)。见表1。

表1 Hela细胞在不同作用方式下Caspase-9、p-AKT蛋白表达情况

与正常细胞组比较：1)P<0.01；与病毒组比较：2)P<0.01

3 讨 论

细胞凋亡是当代研究的热点，其途径众多〔5～8〕。目前已知外源性通路(死亡受体途径)，内源性通路(线粒体途径)和内质网通路〔9〕三条经典的通路，线粒体途径是其一，而活化的Caspase-9是线粒体途径中较为上游的分子，它能够激活其他下游Caspase蛋白(主要为Caspase-3)，引起细胞凋亡。在经典通路之外,还存在其他凋亡相关的通路p-AKT信号通路就是其中之一，它能够抑制凋亡，p-AKT是次通路上游且重要的分子，能够抑制下游分子,进而抑制凋亡向下进行。呼吸道合胞病毒感染HeLa细胞后,能够引起HeLa细胞凋亡,但具体机制不明,本实验说明肉桂醛的抗呼吸道合肥病毒与凋亡相关蛋白Caspase-9和p-AKT表达有一定关系，但凋亡通路复杂，具体促凋亡及抑凋亡机制还需进一步研究。

4 参考文献

1代立娟,韩有文,李绍民,等.肉桂醛对RSV宿主细胞Bcl-2蛋白和Bax蛋白表达的影响〔J〕.中国老年学杂志,2014；34(6):1575-7.

2刘 蕾,刘志新,王淑湘,等.翻白草油对RSV感染宿主HeLa细胞Fas/FasL蛋白表达的影响〔J〕.中国病原生物学杂志,2014；9(5):403-7.

3刘爱华,陈洪忠.肉桂挥发油——β-环糊精包结物的研究〔J〕.山东医药工业,1997；(4)：3-4.

4代立娟,王 琳,冯 澜.肉桂醛抗呼吸道合胞病毒的作用〔J〕.中国老年学杂志,2013;33(6):1309-12.

5刘江涛,郭 雄,吴翠艳,等.线粒体细胞色素c介导的caspase-9激活通路参与大骨节病关节软骨细胞凋亡的发生机制〔J〕.西安交通大学学报(医学版),2011;32(5):580-8.

6程新燕,符翠莉.芹菜素对大鼠骨肉瘤细胞凋亡及相关蛋白Bax,Bcl-2,Caspase-3,Caspase-9,细胞色素C的影响〔J〕.中国实验方剂学杂志,2016；22(15):139-42.

7张凤梅,李洪源,李 霞,等.败酱草多糖体外抗呼吸道合胞病毒作用的研究〔J〕.黑龙江医药科学,2006；29(1):48-50.

8朱铁锐,冯海军,孙 琳.病毒唑雾化吸入治疗婴幼儿呼吸道合胞病毒所致流行性喘憋性肺炎疗效观察〔J〕.黑龙江医药科学,1999;22(4):48.

9赵彦超,顾 耘.细胞凋亡通路研究进展〔J〕.现代医学,2013；41(4):285-8.