肝细胞癌组织中Toll样受体3的表达变化及其意义

袁明明，任晓燕，谢慧君，王伟伟

(1南通市妇幼保健院，江苏南通226006；2南通瑞慈医院)

原发性肝细胞癌(HCC)是发生在肝细胞与肝内胆管上皮细胞的最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在全世界肿瘤中居第六位，其病死率在肿瘤中居第二位[1]，江苏南通地区的启东市是世界卫生组织确定的HCC高发研究现场。Toll样受体3(TLR3)是Toll样受体(TLRs)家族的一个重要成员，是病毒双链RNA(dsRNA)识别受体。其基因定位于染色体4q35，分子量为117 kDa，其分子结构的主要特征是存在高度保守的toll同源区。在人类癌肿中触发TLR3信号通路主要偏向导致细胞凋亡[2]。目前关于TLR3在HCC组织中表达情况的相关报道较少。本研究观察了HCC组织中TLR3的表达变化，探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取南通瑞慈医院2007年1月～2012年12月间经手术切除的HCC患者85例，其中男70例、女15例，年龄19～81岁，平均52.6岁；术前均未接受放疗、化疗或生物等治疗，均经病理检查证实为HCC。术中均留取HCC癌组织及癌旁组织(距肿瘤2～3 cm)处的正常组织标本，常规10%中性福尔马林液固定、石蜡包埋以及4 μm切片，备用。

1.2 HCC癌组织及癌旁组织TLR3检测方法 采用SP免疫组化染色法。兔抗人TLR3购自ABCAM公司。切片脱蜡水化，制成4 μm厚连续切片；抗原热修复处理，入Citrate柠檬酸抗原修复液(0.01 mol/L，pH6.0)，微波高火煮沸10 min；室温自然冷却，入内源性过氧化酶阻断剂10 min；PBS冲洗3次，分别加入单抗，37 ℃恒温箱孵育30 min； PBS液冲洗3次，加二氨基联苯胺四盐酸显色。TLR3阳性染色定位于细胞质或细胞膜，呈棕黄色细颗粒状。按阳性细胞所占百分比测算TLR3阳性表达率。无明显阳性细胞为阴性，阳性细胞数<50%为低表达，阳性细胞数≥50%为高表达。

1.3 随访方法 术后随访至2017年10月，随访方法采用门诊复诊和电话随访；随访内容包括一般情况、AFP、肝脏B超或CT、HCC是否复发等。HCC复发的诊断标准为：B超或CT发现肝脏实性占位，并参考同期AFP检测水平。

1.4 统计学方法 采用SPSS19.0统计学软件进行数据处理。计数资料采用双侧χ2检验，相关性分析采用Spearman等级相关分析。对有随访结果的病例单因素分析用Log-Rank检验并做出Kaplan-Meier生存曲线。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

HCC癌组织及癌旁组织TLR3的阳性表达率分别为58.8%(50/85)、71.8%(61/85)，二者比较，P<0.05。

TLR3表达与HCC临床病理参数的关系见表1。由表1可见，TLR3表达与HCC分化程度、TNM分期、复发有关(P均<0.01)，与HCC患者年龄、性别、HBsAg感染、血清AFP水平、有无肝硬化、肿瘤直径、肿瘤数目及有无脉管侵犯无关(P均>0.05)。

表1 TLR3表达与HCC患者临床病理参数的关系(例)

85例患者随访率89.4%(76/85)，随访时间1～96个月，平均26个月，随访频率1次/3～4月，其中36例术后复发，43例无复发。共有72例死亡，71例死于HCC，1例死于其他因素。患者1、3、5年总生存率(OS)分别为56.6﹪(43/76)、27.6﹪(21/76)、10.5﹪(8/76)。TLR3阴性、低表达及高表达者五年OS分别为0、4.5%(1/22)、25.0%(7/28)，两两比较，P均<0.05，见图1。

图1 HCC患者的生存曲线

3 讨论

HCC是由肝细胞或肝内胆管上皮细胞起源的恶性肿瘤，目前虽然HCC病因尚未完全明确，但目前公认的三大危险因素(病毒性肝炎、饮用水污染和黄曲霉毒素)均可导致体内长期慢性的炎症过程，促进了肿瘤的发生和发展。而作为全球最具威胁性的传染性病原体之一的HBV病毒，是导致慢性肝炎、肝硬化及HCC的主要因素。早期手术切除是HCC目前唯一有效的治疗方法，化疗和放疗大多不能取得满意效果，因此，分子靶向治疗在HCC治疗中的研究已经迫在眉睫。

TLR3作为先天性免疫反应受体Toll样受体家族的一员，通过识别高度保守的病原体相关分子模式(PAMPs) 来介导先天性免疫应答。参与炎性细胞因子的释放，并诱导宿主初始的抗细菌及抗病毒反应。TLR3激动剂的应用不仅能够促进先天性免疫反应，还可增强抗体依赖性效应功能及适应性免疫反应。TLR3可能成为治疗某些癌症的关键性靶点。TLR3已被证实在多种肿瘤细胞如乳腺癌、结肠癌、肺癌及黑色素瘤中均可表达，但其相关作用机制并未完全阐明[3～5]。在HCC中，TLR3被认为可能是其通过下游分子诸如caspases、INF-γ或者NF-κB等来影响肿瘤的血管生成及肿瘤细胞的生长或扩散等关键过程[4]。Yoneda等[5]证明TLR3表达于HCC细胞的胞膜及胞质，52.7%的肝细胞癌组织切片呈TLR3阳性。细胞质中TLR3可能参与了细胞凋亡，而细胞表面的TLR3则诱导激活了其下游的NF-κB途径。由dsRNA激活的TLR3直接抑制细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡[6]。有学者[7]发现HCC肿瘤细胞TLR3高表达的患者，其平均生存期高于低表达的患者，证实了TLR3通路的激活在肿瘤微环境中的作用。TLR3在HCC中的表达与细胞凋亡及血管生成存在密切关系，提示TLR3的下调使控制细胞增殖和组织内环境稳定的生理性生长调控机制发生紊乱，从而使细胞恶性转化[8]。Eiró等[9]发现TLR3在HCC细胞的表达与HCC肿瘤大小有关，而肿瘤大小是公认的HCC预后最重要的指标。最近也有学者[10]证实TLR3基因的多态性+1234 C/T与HCC的易感性有关，基因多态性可能是HCC一种新的危险因素，尤其是HBV相关的HCC。

HCC病死率位居全世界肿瘤中第二位。近年来归因于更好的治疗方案及监测方法，HCC患者5年OS有所提高，发达国家更是达到17.0%[11]。TLR3激动剂也是有效的免疫佐剂，并且已经在癌细胞的诱导凋亡中发挥较好效果。TLR3作为一种靶向治疗癌症的新型分子，目前已经得到了重新认识。TLR3其合成的配体poly(I:C)能够诱导肿瘤细胞凋亡，并可抑制肿瘤细胞的转移[12,13]。另一种TLR3 dsRNA激动剂BM-06也能够抑制HCC肿瘤的生长及肿瘤细胞的增殖，并且优于poly(I：C)[14]。

本研究结果发现，HCC癌组织中TLR3的阳性表达率明显低于癌旁正常肝组织，表明HCC癌组织中存在TLR3的表达下调。通过比较HCC中TLR3表达与HCC临床病理参数的关系，我们发现在HCC低分化程度、TNM高分期及肿瘤术后复发时，TLR3表达水平均下降，表明了TLR3对HCC发生、进展发挥负性调控作用。高表达TLR3的HCC患者临床预后较好，其可作为HCC患者预后良好的判断因子。

综上所述，HCC癌组织TLR3表达降低，TLR3可能参与了HCC的发生、发展。

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