基于超高效液相色谱-串联质谱法探讨柴胡多炔对小鼠CYP450酶活性的影响

吴 莉,张 峰,王 鹏,2,赵 芳,秦雪梅,高晓霞*

(1山西大学中医药现代研究中心,太原 030006;2山西大学化学化工学院;*通讯作者,E-mail:gaoxiaoxia@sxu.edu.cn)

药物生物转化的场所主要为肝脏,多数介导药物生物转化的代谢酶也集中于此。催化药物Ⅰ相代谢的关键酶主要为细胞色素P450酶系(cytochrome P450 enzyme,CYP450 enzyme),此外还有黄素单加氧酶、醇脱氢酶及羧酸酯酶等[1];催化药物Ⅱ相代谢的酶有多种,如UDP-葡萄糖醛酸转移酶、谷胱甘肽-S-转移酶、胞质硫酸转移酶等[2]。临床中,多数药物的Ⅰ相代谢由CYP450酶催化,由CYP450酶介导的Ⅰ相代谢过程通常是药物在体内清除的限速步骤[3,4]。在人类CYP450酶系中,发挥代谢作用的CYP450酶的亚型主要有CYP1A2(底物为非那西丁)、CYP2B6(依法韦仑)、CYP2C8(紫杉醇)、CYP2C9(甲苯磺丁脲)、CYP2D6(右美沙芬)、CYP2E1(氯唑沙宗)、CYP3A4(睾酮)和CYP2C19(S-美芬妥英)[1]等。

肝脏中的CYP450酶是介导药物Ⅰ相代谢中氧化反应的主要代谢酶之一。而CYP450酶的活性会受某种化合物的影响。这种因某种化合物引起CYP450酶的活性发生变化,从而影响其他药物代谢的现象,被称为基于CYP450酶的潜在药物-药物相互作用(drug-drug interaction,DDI)。实验室前期实验已经证明CYP450酶参与柴胡多炔的生物转化过程,因此,本实验拟采用CYP450酶特异性探针药物法,将FDA推荐的特异性探针药物加入鼠微粒体孵育体系中,结合多反应检测模式(MRM)定量分析方法,检测探针药物在含柴胡多炔的肝微粒体共孵育体系中代谢前后的反应抑制率,从体外角度初步评价柴胡多炔对CYP450酶活性的潜在影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 仪器 Agilent 1290 Infinity Ⅱ超高效液相色谱仪(美国Agilent公司),AB Sciex 3200 Qtrap质谱仪(AB Sciex公司),ThermoCell恒温振荡金属浴(杭州博日生物科技有限公司),Neaofuge13R台式高速离心机(力康生物科技有限公司),Milli-Q超纯水净化系统(美国密理博公司),KQ5200E超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司),Sartorius电子分析天平(德国赛多利斯SARTORIUS有限公司)。

1.1.2 试药与试剂 非那西丁Phenacetin(批号:1201A021,纯度:98%,北京索莱宝科技有限公司);依法韦仑Efavirenz(T2393,98%),紫杉醇Paclitaxel(T0965,98%),氯唑沙宗Chlorzoxazone(ITM-3070,98%),甲苯磺丁脲Tolbutamide(T0968,98%)均购于上海陶素生化科技有限公司;右美沙Dextromethorphan(SJDW002 98%)购自瑞德肝脏疾病研究(上海)有限公司;睾酮Testosterone(1116A021,98%)购自北京索莱宝科技有限公司;丹皮酚Peaonol(A0054,98%)购自曼斯特生物科技有限公司;大黄素Emodin(A0044,98%)购自中国药品生物制品检定所。乙腈和甲酸为色谱级Fisher Scientific(USA),其他试剂均为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 探针底物标准品溶液配制 取各探针底物适量,精密称定,用乙腈溶解至所需浓度,作为质量控制(QC)溶液。精密量取各探针底物QC溶液适量,配制探针底物不同浓度的标准系列溶液(浓度由低到高分别为SD 1-7)。探针底物QC溶液及各标准系列溶液检测时浓度见表1。

表1探针底物QC溶液与标准系列溶液的配制

Table1PreparationofQCsolutionandstandardsolutionforstutrates

溶液浓度(μmol/L)非那西丁紫杉醇右美沙芬睾酮依法韦仑甲苯磺丁脲氯唑沙宗QC100000 150000 5000 75000 80000 150000 60000 SD 750075025.0375400750300SD 625037512.5188200375150SD 51001505.0075.080.015060.0SD 450.075.02.5037.540.075.030.0SD 325.037.51.2518.820.037.515.0SD 210.015.00.507.508.0015.06.00SD 16.259.380.314.695.009.383.75

1.2.2 探针底物孵育液的配制 取各探针底物适量,精密称定,用DMSO溶解,作为储备液,精密量取各探针底物,用新制的PBS缓冲液稀释,配制的探针底物孵育液浓度分别为:CYP1A2 50.0 μmol/L,CYP2B6 40.0 μmol/L,CYP2C8 75.0 μmol/L,CYP2C9 75.0 μmol/L,CYP2D6 2.50 μmol/L,CYP2E1 30.0 μmol/L,CYP3A4 37.5 μmol/L。

1.2.3 内标溶液的配制 分别取丹皮酚和大黄素适量,精密称定,乙腈定容,配制成浓度分别为10 μmol/L和2 μmol/L的内标溶液,-80 ℃保存备用。

1.2.4 生物样品孵育方法及预处理 样品组在孵育体系中另加入各探针底物,孵育完全后用200 μl含丹皮酚和大黄素的乙腈终止反应。

参考文献[5]方法,进行鼠肝微粒体温孵及样品的预处理:温孵终体系中包括PBS缓冲液(pH 7.4),NADPH再生系统(NADP+1.0 mmol/L,G-6-P 10.0 mmol/L,G-6-PDH 1.0 U/ml,MgCl2·6H2O 4.0 mmol/L),肝微粒体1 mg/ml,柴胡多炔RB-2/RB-4 100 μmol/L。温孵体系终体积为200 μl,样品准备过程在冰浴中操作(体系中DMSO终浓度不超过0.1%)。实验开始时,将不含NADPH再生系统的温孵液置于37 ℃恒温振荡器中预孵育3 min,然后加入NADPH再生系统启动反应。37 ℃恒温振荡(300 r/min)孵育60 min后,立即加入200 μl冰冷乙腈(4 ℃)终止反应。样品涡旋混合2 min,静置1 min,4 ℃下15 000g离心10 min,取上清液进样分析。

阳性对照组孵育体系中,除不加柴胡多炔改加相应体积的PBS缓冲液外,孵育方法及样品处理过程同“鼠肝微粒体温孵方法及样品的预处理”。

1.2.5 色谱条件与质谱条件 色谱条件:Waters HSS T3柱(1.8 μm,10 mm×2.1 mm),保护柱:Waters HSS T3VanGuard柱(1.8 μm,2.1 mm×5 mm);流动相为水(含0.1%甲酸)(A)-乙腈(B),梯度洗脱:0-0.2 min,45%→45%A;0.2-3.2 min,45%→5%A;3.2-4.0 min,5%→45%A;4.0-6.0 min,45%→45%A;体积流量:0.2 ml/min;柱温:37 ℃;进样量5 μl,全波长扫描。

质谱条件:电喷雾离子源(ESI),检测电压:正极5 500 V,负极4 500 V,扫描方式:多反应监测模式(MRM),气帘气(N2)压力40 psi,离子源温度500 ℃,雾化气(N2)压力50 psi,干燥气(N2)压力50 psi。

MRM定量分析各探针底物的检测质核比、检测类型、其他质谱参数和保留时间见表2。

表2探针底物及内标的液质联用检测参数

Table2MRMparametersofsevensubstratesandinternalstandards(IS)

CYP450酶底物 离子化形式保留时间(min)质荷比(m/z)母离子子离子DP(V)CE(eV)CYP1A2非那西丁ESI+2.001801106626CYP2C8紫杉醇ESI+3.418542864525CYP2D6右美沙芬ESI+1.492721716545CYP3A4睾酮ESI+3.092891096731IS+丹皮酚(IS+)ESI+3.021671495118CYP2B6依法韦仑ESI-3.97314244-65-21CYP2C9甲苯磺丁脲ESI-2.77269170-45-26CYP2E1氯唑沙宗ESI-2.31168132-55-25IS-大黄素(IS-)ESI-3.93269225-66-36

DP:去簇电压;CE:碰撞能量

1.2.6 分析方法的确证

1.2.6.1 专属性 取空白孵育基质,用相同体积的乙腈代替含内标的乙腈,其他处理方法同“1.2.4生物样品孵育方法及预处理”;将一定浓度的标准溶液和内标溶液加入空白基质中,按“1.2.4生物样品孵育方法及预处理”项操作;取孵育样品,按“1.2.4生物样品孵育方法及预处理”操作。检测空白孵育基质中所含内源性成分对待测物及内标的测定没有干扰。

1.2.6.2 标准曲线的线性范围 在空白孵育基质中加入不同浓度的待测物标准品溶液,按“1.2.4”项操作。标准曲线方程的横坐标为待测物浓度,纵坐标为待测物与内标的峰面积之比,计算时采用加权(1/x2)最小二乘法进行线性回归,求得线性回归方程作为标准曲线。

1.2.6.3 精密度与准确度 分别在空白孵育基质中准确加入低、中、高3个浓度的待测物标准溶液,按“1.2.4生物样品孵育方法及预处理”项操作,每组6样本分析,并与标准曲线同时进行,计算样品浓度,求得精密度与准确度。

1.2.6.4 提取回收率 分别在空白孵育基质中准确加入低、中、高3个浓度的待测物标准溶液,按“1.2.4生物样品孵育方法及预处理”项操作,每个浓度6样本分析,获得相应峰面积A1。另取空白孵育基质,其他操作按“1.2.4生物样品孵育方法及预处理”项,在所得上清液中加入低、中、高三个浓度的待测物标准溶液和内标溶液,获得相应峰面积A2,用每个浓度两种处理方法计算待测物峰面积(A1/A2)的提取回收率。

1.2.6.5 基质效应 取空白孵育基质,其他操作按“1.2.4生物样品孵育方法及预处理”项,在所得上清液中加入低、中、高3个浓度的待测物标准溶液和内标溶液,每一浓度3样本平行操作,获得待测物峰面积A2。另用流动相直接配制相同理论浓度的待测物,按“1.2.4生物样品孵育方法及预处理”项对样品进行预处理,得待测物峰面积A3。二者峰面积之比即为基质效应。

1.2.7 柴胡多炔对ICR小鼠肝微粒体CYP450酶的影响 以阳性对照组中各探针底物减少量为标准,样品组中各探针底物减少量为评价指标,计算样品组各探针底物减少率,通过探针底物减少率间接反映柴胡多炔对CYP450酶的抑制作用。探针底物减少率(%)=(1-C样品组/C对照组)×100%(n=3)。

2 结果

2.1 方法学验证

2.1.1 专属性 7种探针底物典型EIC图结果可见,空白孵育基质中的内源性物质对待测物及内标的测定没有干扰(见图1)。

2.1.2 线性范围 7种探针底物的标准曲线及线性范围见表3。线性回归r2均大于0.99。

A.空白基质 B.空白基质+各探针底物(SD3) C.孵育样品每列从上往下分别为非那西汀，紫杉醇，右美沙芬，睾酮，丹皮酚(IS+)，依法韦仑，甲苯磺丁脲，氯唑沙宗，大黄素(IS-)探针底物；Int.是Intensity图1 七种探针底物及内标的MRM图谱Figure 1 Representative MRM chromatograms of seven substrates and internal standards

表3七种探针底物的标准曲线

Table3Standardcurvesofsevensubstrates

CYP450酶底物回归方程r2线性范围(μmol/L)定量限(μmol/L)CYP1A2非那西丁 Y=1.7X+9.020.99276.25-5006.25CYP2C8紫杉醇 Y=0.209X+0.5240.99259.38-7509.38CYP2D6右美沙芬 Y=14.1X-2.740.9901 0.31-25.00.32CYP3A4睾酮 Y=1.9X-2.070.99354.69-3754.69CYP2B6依法韦仑 Y=0.0187X-0.01330.99015.00-4005.00CYP2C9甲苯磺丁脲 Y=0.568X+5.220.99929.38-7509.38CYP2E1氯唑沙宗 Y=0.133X+0.1060.99543.75-3003.75

2.1.3 精密度与准确度 各探针底物的批内精密度与准确度见表4。所有探针底物的精密度(RSD)范围在1.4%-14.1%,准确度(RSD)在1.7%-11.2%范围内。

2.1.4 提取回收率 按“1.2.6提取回收率”项操作,得各探针底物提取回收率,结果显示该处理方法的提取回收率范围为83.3%-114.6%,RSD范围在2.7%-17.5%之间(见表4)。

2.1.5 基质效应 按“1.2.6基质效应”制备样本,测得各探针底物基质效应,结果表明基质对待测化合物干扰小,范围均在90.6%-110.1%,RSD范围为1.8%-13.6%(见表4)。

表4七种探针底物的精密度、准确度、提取回收率及基质效应(n=6)

Table4Precision,accuracy,recoveryandmatrixeffectofsevensubstrates(n=6)

底物加入浓度(μmol/L)精密度浓度(μmol/L)RSD(%)准确度RSD(%)回收率基质效应平均值(%)RSD(%)平均值(%)RSD(%)非那西丁1010.279.311.990.312.190.6 11.65057.3611.512.387.29.6103.36.3400445.66.97.0114.65.9110.18.8紫杉醇1512.4514.111.2108.017.591.310.97566.593.23.483.314.296.213.6600544.98.07.291.510.396.95.9右美沙芬0.50.6204.22.8110.24.499.86.52.52.86310.59.8109.18.593.412.72020.994.95.7111.512.491.94.9睾酮7.57.74512.710.9118.97.4101.51.837.536.706.16.0107.02.798.58.6300281.82.73.693.610.392.312.3丹皮酚(IS+)5.00- - - 89.73.2- -依法韦仑865.037.47.3111.718.1100.69.440372.97.88.194.65.597.36.932026384.86.898.16.099.59.4甲苯磺丁脲1515.723.86.197.89.398.2157585.021.41.791.913.490.96.8600501.97.37.596.212.899.52.0氯唑沙宗66.8628.310.8100.18.3104.29.63034.483.63.894.57.194.98.8240265.87.17.294.813.2103.34.7大黄素(IS-)1.00- - - 93.51.7- -

2.2 柴胡多炔对ICR小鼠肝微粒体CYP450酶的影响

根据“1.2.7”项公式计算,得柴胡多炔RB-2和RB-4对各亚型CYP450酶的抑制结果(见图2)。结果显示,浓度为100 μmol/L柴胡多炔RB-2和RB-4对CYP1A2的探针底物的代谢表现出较弱的抑制作用,底物减少率分别为38%和24%,间接反映出对CYP1A2具有微弱的抑制,对其他代谢酶代谢抑制率均小于10%。

3 讨论

在人类CYP450酶系中,发挥代谢作用的CYP450酶的亚型主要有CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4等[1]。CYP1A2约占肝脏中CYP450酶的4%-16%,能催化芳香族化合物发生氧化和羟基化反应,通常平面性较强的化合物如芳香胺类化合物和杂环化合物的代谢易受CYP1A2的影响[6]。CYP2B6在个体间的表达具有较大差异,平均约占肝脏中CYP450酶的1%-2%[7],它不仅能代谢临床中常见药物,一些环境中存在的化学物质也通常能被其代谢,在结构方面,一些中性或弱碱性非平面的亲脂性化合物在代谢过程中易受CYP2B6的介导[1]。CYP2C8在肝脏CYP450酶中的表达量约为11-29 pmol/mg,在不同的人种间具有较大的差异,与CYP2C家族中其他代谢酶相比,其催化活性较低[8]。CYP2C9是CYP2C家族中含量最高的CYP450酶,它主要代谢弱酸性物质,参与花生四烯酸等内源性物质的代谢过程[9]。对于CYP2C19,多数酰胺类化合物及含有2-3个氢键受体的化合物能被其代谢。CYP2C19在临床代谢表型分类中有快代谢者和慢代谢者,也是质子泵抑制剂和抗抑郁药物的主要代谢酶之一[10,11]。CYP2D6是CYP2D家族中唯一具有蛋白编码的酶,因其具有遗传多态性,在个体间的表达具有较大的差异。虽然CYP2D6在肝脏CYP450中所占比率较小,但参与约15%-25%临床用药的代谢过程[12]。CYP2E1在肝脏中的表达量较其他CYP450酶相对较低,代谢过程中,CYP2E1通常倾向参与低分子量及小分子药物的代谢过程[13]。CYP3A4是CYP450酶中含量较高的酶,约占肝脏中CYP450酶的25%-30%,且在药物代谢过程中发挥着主导作用。CYP3A4的活性位点空间足够大,受体和配体对接方式灵活,能够容纳和适应许多亲脂性化合物或较大的药物分子,临床中多数药物代谢过程通常都有CYP3A4的参与[14]。CYP1A2,CYP2B6,CYP2C8,CYP2C9,CYP2D6,CYP2E1,CYP3A4与多数临床药物的代谢相关。

图2 柴胡多炔RB-2和RB-4对CYP450酶的抑制作用Figure 2 Inhibitory effect of RB-2 and RB-4 on CYP450 enzyme

本实验选用FDA推荐的探针底物为研究对象,建立测定7种探针底物UHPLC-MS/MS定量分析方法。该方法具有较强的专属性和高灵敏度。并通过检测探针底物的变化间接评价不同亚型CYP450酶的活性。实验结果初步表明,柴胡多炔RB-2/RB-4对CYP1A2的活性具有较弱的抑制作用,对其他亚型代谢酶的无抑制作用。

该部分实验通过探针底物的变化从体外角度间接反映柴胡多炔RB-2/RB-4对酶活性的影响,但并不能完全证实是否会引起CYP450酶表达量等的改变,因此需要后续实验进一步验证,如测定酶蛋白的活性及mRNA表达量,或直接给予实验动物柴胡多炔和特异性探针底物,通过监测探针底物在体内的变化等直接或间接检测代谢酶活性或表达的方法加以确证。

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