试论丙型肝炎病毒抗体双抗原夹心法化学发光检测的应用

陈赢 於瑞敏

摘 要：目的：研究丙型肝炎病毒抗体双抗原夹心法化学发光检测的应用。方法：采集250份血液筛选结果为阴性标本以及250例质控血液样本，分别对其应用双抗原夹心法进行丙型肝炎病毒抗体检测，并对结果进行统计分析。结果：本组208例HCV抗体阳性样本中，一共检出206例，敏感性为99.04%。结论：采取双抗原夹心法对HCV抗体进行检测的结果准确可靠，敏感性较高，临床优势显著，值得关注并推广。

关键词：丙型肝炎病毒抗体；双抗原夹心法；化学发光检测；应用

引言

在血液筛查中，丙型肝炎病毒（HCV）是一项重要的血液筛查项目，目前主要应用到的检测方法包括化学发光法、酶联免疫法、时间分辨荧光免疫分析法，这些检测方法都是间接检测的方法。但是这些检测方法具有假阳性率高的缺陷，进而增加了临床检验成本，也给患者造成了不必要的精神负担。因此，设计一种具有高灵敏性的Anti-HCV检测方法就显得极其重要。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1标本材料来源

标本材料来源于2016年1月-2017年1月间南京市人民医院血液筛选阴性样本，随机抽取其中的250份作为研究对象，并收集250份质控血液样本。

1.1.2试剂材料来源

双抗原夹心法HCV抗体诊断试剂盒（酶联免疫法）：北京万泰生物（国药准字：S20130002，批号：2015061008），以下简称万泰双抗原夹心法。

上海浩源生物科技有限公司的丙型肝炎病毒人类免疫缺陷病毒（I型）核酸检测试剂盒（PCR-荧光法）（国药准字S20110011）。

1.2方法

选择本次选取的一共500份血液标本进行严格的检测，并应用双抗原夹心法对HCV抗体进行检测。

1.2.1抗原制备

第一，生物标记抗原的制备。取一定量重组融合的HCV抗原，并应用pH9.5、0.05mol/L的CB将其浓度调整为1mg/mL；根据抗体：生物素=1：10-20mol的比例添加适量已活化的生物素，在温室中反应0.5-1.0h；将反应液移入透析袋内，并应用pH9.5、0.05mol/L的CB透析24h，最后加入等量的甘油，将其放置在零下20℃内进行保存。第二，吖啶酯标记抗原的制备取一定量重组融合HCV抗原，采用pH9.5、0.05mol/LCB调整浓度为1mg/mL；按抗原：吖啶酯=1：10-20mol比加入已活化吖啶酯，室温反应0.5-1.0h；将反应液移至透析袋，采用pH9.5、0.05mol/LCB透析24h，加入等量甘油，放置在零下20℃内进行保存。

1.2.2操作方法

首先，将样本与吖啶酯标记重组抗原与生物素标记重组丙型肝炎抗原进行反应，然后让其生成抗原-抗体-抗原的夹心式复合体，将链霉亲和素磁微粒加入其中，让复合体与之相互作用，形成固相。其次，将反应液放置在磁场内，在反应液中的磁微粒吸附完全后，对其进行洗涤，除去未结合物。最后，注入化学发光激发液，检测其化学发光光子的强度，并根据临界值对其是否含有Anti-HCV样品进行判定。

2结果

应用双抗原夹心法对标本进行检测，在250份标本中，206例为阳性标本，2例为阴性样本，应用ChironRIBA确认试剂对其进行检测，发现均成阳性，双抗原夹心法检测的敏感性为99.04%。具体情况详见表1。

3讨论

丙型肝炎呈全球性流行，全球HCV的感染率约为3%，我国一般人群Anti-HCV阳性率为3.2%，丙型肝炎慢性化率为50%-85%，慢性丙型肝炎的肝硬化率为10%-15%，失代偿期肝硬化的10年生存率仅为25%，慢性丙型肝炎导致的肝硬化患者中，每年肝癌发生率为1%-7%。HCV常呈隐匿性感染，容易被忽视。一旦感染HCV，病程越长，越难治愈；慢性丙型肝炎可逐渐进展成肝硬化、肝细胞癌等严重肝脏疾患，从而造成沉重的身心负担，故应重视丙型肝炎的筛查。丙型肝炎已有有效的治疗药物，如能及早治疗，可防止其发展为肝硬化和肝癌。对丙型肝炎早期筛查、早期诊断、早期治疗十分重要。因此，研制一种高灵敏度、高特异的试剂盒对丙型肝炎的防治有着重要的意义。

对患者HCV抗体进行检测是确定其是否发生感染的初步阶段，主要有用作筛检工作的酶免疫检测（EIA）以及用作确证工作的重组免疫印迹试验（RIBA），其中RIBA由于需要较高费用且并未建立严格试验标准，目前在临床诊疗中并无较多应用。由于EIA存在较为明显的便利性及稳定性、自动化功能强、价格较低等优点，在临床中应用到血液筛查及检测工作中较为广泛。目前EIA发展至第三代，依然实施间接法予以检测，因其方法学存在一定固有缺陷性，极易导致结果出现假阳性及漏检情况。目前在临床中将双抗原夹心酶联免疫吸附实验法检测试剂作为发展方向具有较为明显的应用价值，夹心法可使得酶标记的特异性抗原将间接法检测时酶标记的抗体进行取代，由此完成整个检测，与间接酶联免疫吸附实验法进行比较，其对于样品检测存在双特异性选择特点，可以将血清内出现的抗HCV的总抗体完成检测，有效防止间接酶联免疫吸附实验法所存在的检测弊端，确保检测结果具有更高的敏感性与特異性，而且因为HCV抗原所具有的分子量较小，以酶进行HCV抗原的直接性标记，往往使得空间位阻情况发生，导致抗体与抗原无法轻易结合，存在较为明显抑制作用，因此HCV抗原的标记是建立抗HCV抗体的双抗原夹心ELISA检测方法的一个较为重要的难点。

结束语

应用双抗原夹心法化学发光检测实验，可以有效提高HCV感染诊断试剂的特异性以及其检出率，并有效缩短检出时间，在临床上值得推广使用。

参考文献：

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[2]周齐洋，张娜娜.丙型肝炎病毒抗体双抗原夹心法化学发光检测的应用[J].标记免疫分析与临床，2016，03：324-326.

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