激活或阻断内侧隔斜角带复合体中5-HT1A受体对帕金森病模型大鼠认知功能的影响

李立博，李坤颖，郭方圆，李文娟，席 悦，乔鸿飞，杨 峰，张巧俊

(西安交通大学医学院第二附属医院康复医学科，陕西西安 710004)

认知功能障碍是帕金森病(Parkinson’s disease, PD)常见的非运动系统症状，在PD患者中发病率高达40%，导致患者的执行能力和记忆力下降[1]。5-羟色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)递质系统与高级认知功能密切相关[2]。5-HT1A受体在与认知功能密切相关的核团中分布广泛。体循环给予5-HT1A受体激动剂，损害了大鼠在水迷宫实验中的学习记忆、目标识别和被动回避能力，阻断5-HT1A受体可以改善记忆损害[3]。这些研究说明5-HT1A受体与认知功能密切相关。

内侧隔斜角带复合体(medial septum-diagonal band of Broca complex, MS-DB)在认知过程中发挥重要作用。研究发现，MS-DB通过调节海马theta节律影响认知功能，theta节律是海马神经元同步化活动形成的局部场电位，与记忆有关[4]。MS-DB是theta节律形成的关键核团[5]，该核团接受来自中缝中核(median raphe nucleus, MRN)的5-HT能纤维投射，表达多种5-HT受体亚型，以5-HT1A受体最为丰富[6]。因此，激活或阻断MS-DB中的5-HT1A受体可能是通过调节海马theta节律影响PD认知功能，而目前并未见研究探讨MS-DB中5-HT1A受体对PD认知障碍的调节作用及机制。因此，本研究以6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine, 6-OHDA)损毁的PD模型大鼠为研究对象，采用行为学和电生理学方法，观察激活或阻断MS-DB中5-HT1A受体对PD认知功能和海马theta节律的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物及试剂用健康、雄性Sprague-Dawley大鼠(270～320 g)，由西安交通大学动物实验中心提供。大鼠在标准环境饲养，室温20～25 ℃，12 h昼夜循环光照，自由摄食饮水。严格执行西安交通大学实验动物使用的相关规定，尽量减轻痛苦并减少大鼠的使用数量。

6-OHDA、阿朴吗啡(apomorphine, APO)、8-OH-DPAT及WAY100635均购自美国Sigma公司。2 mg 6-OHDA溶于1 mL含0.2 g/L抗坏血酸的生理盐水，0.05 g APO溶于100 mL含0.2 g/L抗坏血酸的生理盐水、8-OH-DPAT及WAY100635均溶解于生理盐水。所有溶液现配现用。

1.2实验分组及大鼠PD模型的建立随机分为假手术组和模型组。模型组大鼠又随机分为4个亚组，分别为生理盐水组、8-OH-DPAT组、WAY-100635组和WAY-100635+8-OH-DPAT组。建立PD模型的方法[7]应用6-OHDA损毁单侧(左侧)内侧前脑束(medial forebrain bundle, MFB)。水合氯醛(400 mg/kg, i.p.)麻醉大鼠并将其头部固定于脑立体定位仪上。依据Paxinos-Watson大鼠脑立体定位图谱确定左侧MFB的位置(AP -4.4 mm，L 1.2 mm，D 7.8～7.9 mm)，利用微电极推进器将玻璃微电极推送至目标位置后，缓慢注射6-OHDA(术前4 ℃避光保存)。假手术组大鼠注射等量含0.2 g/L抗坏血酸的生理盐水，手术方法同模型组大鼠。

采用APO诱导的旋转行为实验检测是否成功建立PD模型。造模后第3周，大鼠颈部皮下注射APO(0.05 mg/kg，s.c.)，若大鼠在注药后1～15 min出现向健侧旋转，且旋转速度超过6圈/min，并且在5 min内大于20圈者，则视为成功的PD模型[8]。本实验中，皮下注射APO使大鼠向健侧旋转的圈数均大于30圈/5 min。

1.3导向套管埋置造模后第3周，模型组大鼠行导向套管埋置术。依据脑立体定位图谱确定左侧MS-DB的位置(AP 0.3 mm, L 1.1 mm, D 5.5 mm)[9]，将不锈钢套管(长2.0 mm，直径0.6 mm)在冠状面与中线成10°角进针以免损伤矢状窦，推进至左侧MS-DB上方1.0 mm的位置。然后用牙托粉将套管固定，等待牙托粉完全凝固后向套管内插入长约2.0 mm的不锈钢内芯防止套管堵塞。术后大鼠恢复1周。

1.4核团内药物注射行为学检测前5 min，按照1.2实验分组，分别经套管在左侧MS-DB内分别注射生理盐水(溶媒)、8-OH-DPAT(高亲和力5-HT1A受体激动剂，0.25 μg/只)、WAY-100635(选择性5-HT1A受体拮抗剂，1.5 μg/只)或WAY-100635(1.5 μg/只)+8-OH-DPAT(0.25 μg/只)。对于注射WAY-100635+8-OH-DPAT的大鼠，先后注射两种药物，间隔时间为5 min。

1.5T-迷宫实验T-迷宫实验用来检测大鼠的工作记忆，参照DEACON和RAMOS-MORENO等[10]的方法，大鼠先进行适应性训练，训练结束后进行18次连续选择试验，具体方法如下：T-迷宫具有两侧目标臂，每次试验均将巧克力置于一侧目标臂，随后将大鼠置于起始区，让其自由选择，若大鼠进入放置巧克力的目标臂并进食巧克力，则认为选择正确，下次试验将巧克力置于另一侧目标臂；若大鼠进入未放置巧克力的目标臂，则认为选择错误，不改变巧克力的放置位置，直到其选择正确再更换位置，连续进行18次选择试验。试验结束后计算选择正确率(正确选择次数/18×100%)。

1.6海马场电位(localfieldpotential,LFP)记录确定左侧海马的坐标位置(AP -5 mm，L 3 mm，D 3.2 mm)[9]，采用单极电极记录，记录到的LFP经MEZ-8301微电极放大器、AVB-11A前置放大器(滤波1～100 Hz)放大，显示于VC-11示波器上，并通过生物电信号采集与分析系统CED1401 Spike2显示并储存于计算机，采样频率设置为100 Hz，记录稳定的海马LFP后，通过给药电极在MS-DB局部注射体积各100 nL的8-OH-DPAT(0.05 μg)或WAY-100635(0.3 μg)，给药后持续记录30 min，然后通过玻璃微电极电泳滂胺天蓝标记记录位点(―20 μA，15 min)。海马LFP的分析采用：每只老鼠随机截取5段LFP信号(每段10 s)，功率谱峰频率在3～6 Hz频带范围内为theta节律。分析theta节律的峰频率和标准化功率，其中峰频率为theta频带的峰值，标准化功率为theta频带的功率占1～50 Hz频带总功率的百分比[11]。

1.7组织学和免疫组织化学电生理记录结束后，大鼠灌注固定，行连续冠状冰冻切片。行尼氏染色用于观察MS-DB和海马的结构及记录位点的准确性，行酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH)免疫组织化学染色法确认腹侧被盖区(ventral tegmental area, VTA)和黑质致密部(substantia nigra pars compacta, SNc)中多巴胺(dopamine, DA)能神经元的变性丢失程度，行5-HT1A受体免疫荧光染色明确该受体在MS-DB的表达。染色后，每只大鼠选取相应位置的3张切片进行SNc及VTA中TH阳性细胞的计数并取平均值，核与胞质完整的细胞方可纳入统计。

1.8统计学分析统计分析使用SPSS 13.0软件，数据均以均数±标准差表示。对于行为学数据，假手术组和模型组大鼠在T-迷宫中选择正确率的比较采用独立样本t检验，局部给予8-OH-DPAT、WAY-100635后选择正确率的比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，多重比较采用Dunnett-t检验。对于电生理学数据，假手术组和模型组大鼠海马theta节律的峰频率和标准化功率的比较采用独立样本t检验，局部给药后峰频率和标准化功率的改变采用配对t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1TH阳性神经元的计数假手术组大鼠的盐水注射侧SNc和VTA中TH阳性神经元的数目轻度降低，与未注射侧相比分别减少(2±1)%和(3±1)%(n=9)。模型组大鼠的损毁侧SNc中的TH阳性神经元完全缺失，而VTA中TH阳性神经元的数目则显著减少到未损毁侧的(35±1)% (n=9，P<0.05，图1)。

图1 模型组大鼠SNc和VTA的TH免疫组织化学染色(A)及损毁侧与未损毁侧VTA中DA能神经元数量的比较(B)Fig.1 Photomicrographs of TH immunohistochemical staining in coronal section of the midbrain in the 6-OHDA-lesioned rats (A) and the SNc and VTA DA neurons on the injected side compared to uninjected side (B)

2.2MFB损毁及5-HT1A受体的激活和阻断对大鼠工作记忆的影响模型组大鼠在T-迷宫实验中的平均选择正确率[(28±1)%]与假手术组[(56±3)%]相比明显降低(n=9，P<0.05，图2A)。单因素方差分析结果显示，模型组大鼠MS-DB局部注射药物对选择正确率产生显著影响(F=22.84，P<0.001，图2B)，检验后多重比较显示，局部注射激动剂8-OH-DPAT(0.25 μg/0.5 μL)组与溶媒组相比，显著降低了选择正确率(P<0.05，图2B)，而拮抗剂WAY-100635(1.5 μg/0.5 μL)组显著增加了选择正确率(P<0.05，图2B)。预先给予WAY-100635(WAY-100635+8-OH-DPAT)可以阻断8-OH-DPAT的效应(与溶媒组相比，P>0.05；与8-OH-DPAT组相比，P<0.05，图2B)。

2.3MFB损毁及5-HT1A受体的激活和阻断对海马theta节律的影响假手术组大鼠海马theta节律的峰频率和标准化功率分别为(4.6±0.1)Hz和(32.0±8.0)%(n=8，图3A、C、E、F)。模型组大鼠海马theta节律的峰频率为(4.0±0.2)Hz，较假手术组显著降低(n=8，P<0.05，图3B、D、E)，标准化功率为(36.0±8.0)%(图3F)，两组相比差异无统计学意义(P>0.05，图3F)。

图2 MFB损毁和MS-DB局部注射5-HT1A受体激动剂8-OH-DPAT或拮抗剂WAY-100635对大鼠工作记忆的影响Fig.2 Effects of unilateral 6-OHDA lesion of the MFB, intra-MS-DB injection of 5-HT1A receptor agonist 8-OH-DPAT and the selective antagonist WAY-100635 on working memory measured by T-maze rewarded alternation tests

图3 假手术组和模型组大鼠海马theta节律的比较Fig.3 Power spectrum from LFP sequences during theta rhythm in sham-operated and 6-OHDA-lesioned rats

模型组大鼠与给药前相比，局部给予8-OH-DPAT(0.05 μg/100 nL)抑制了海马theta节律(图4)，量化分析结果显示，8-OH-DPAT降低了theta节律的标准化功率(n=8，P<0.05；图5)，标准化功率较基础功率降低(61.7±6.8)%，体循环给予WAY-100635(100 μg/kg, i.v)可恢复theta节律，并使其标准化功率升高到基础功率的(206.0±42.1)%(n=6，图4、图5)。与给药前对照组相比，局部给予WAY-100635(0.3 μg/100 nL)可诱发海马theta节律(图4)，显著升高theta节律的标准化功率(n=8，P<0.05)；较基础功率升高[(248.9±59.0)%，n=8，图5]。

图4 模型组大鼠MS-DB局部注射8-OH-DPAT、WAY-100635对海马theta节律的影响Fig.4 Effects of local application of 8-OH-DPAT and WAY-100635 on hippocampal theta rhythm of the 6-OHDA-lesioned rats

图5 模型组大鼠MS-DB局部注射8-OH-DPAT、WAY-100635对海马theta节律标准化功率的影响Fig.5 Effects of local application of 8-OH-DPAT and WAY-100635 on normalized theta power of hippocampal theta rhythm of the 6-OHDA-lesioned rats

2.45-HT1A受体的表达变化模型组大鼠MS-DB中5-HT1A受体的荧光强度为(29.50±1.29)/μm2，较假手术组的(50.25±4.65)/μm2显著降低(n=5，P<0.001，图6)。

图6 假手术组(A)和模型组(B)大鼠MS-DB中5-HT1A受体的免疫荧光染色结果Fig.6 Representative photomicrographs of 5-HT1A immunofluorescent staining in coronal section of MS-DB in sham-operated (A) and the 6-OHDA-lesioned (B) rats

3 讨 论

关于PD模型大鼠是否存在认知障碍的研究结果目前并不一致。一些研究发现6-OHDA或MPTP损毁的PD模型大鼠存在认知功能障碍[12]，而另一些研究则表明6-OHDA损毁并未改变认知行为[13]。这种分歧可能与药物的注射位点、注射剂量、损毁方式、损毁时间、损毁程度和检测认知功能的方法不同等多种因素相关。T-迷宫实验是一种评估工作记忆的行为学方法[10]，大鼠在T-迷宫实验中的选择正确率越高，反映其工作记忆越强。在本研究中，单侧MFB完全损毁降低了大鼠在T-迷宫实验中的选择正确率，提示单侧黑质-纹状体通路变性导致工作记忆损害，该研究结果与以往的报道一致，这可能与海马theta节律的电活动改变有关。研究证实，海马theta节律参与了记忆编码过程，theta节律的峰频率越高，大鼠在十字迷宫中的正确选择率越高[14]，而theta节律的降低与T-迷宫选择正确率降低有关[15]，这些结果说明海马theta节律与工作记忆呈正相关。本研究中，MFB损毁引起海马theta节律的抑制，这是PD模型大鼠工作记忆损害的一个重要原因。

本研究发现，MS-DB局部注射5-HT1A受体激动剂8-OH-DPAT进一步降低模型组大鼠在T-迷宫实验中的选择正确率，提示局部给予8-OH-DPAT损害了工作记忆。这与BERTRAND等[16]的研究结果类似，其研究发现隔区局部注射8-OH-DPAT损害正常大鼠在水迷宫实验中的空间学习能力。分析其原因如下：5-HT递质系统对认知功能具有重要的调节作用[17]，越来越多的证据表明，5-HT1A受体与记忆密切相关。MS-DB表达丰富的5-HT1A受体，该受体为G蛋白耦联受体，可分别作为自身受体和突触后受体分布于缝核和其他脑区的多种神经元，激活后抑制神经元的电活动。本研究电生理学结果显示，模型组大鼠MS-DB局部给予8-OH-DPAT进一步降低了海马theta节律的峰频率，提示5-HT1A受体的激活抑制海马theta节律，这种抑制活动有可能是模型大鼠工作记忆减弱的重要因素。此外，8-OH-DPAT对5-HT7受体亦存在一定程度的亲和力，其可能通过5-HT7受体损害工作记忆。5-HT7受体广泛分布于多个脑区，在MS-DB有少量表达[18]，可与GS蛋白相结合后激活腺苷酸环化酶，兴奋神经元的电活动。但是，有实验采用Morris水迷宫检测大鼠空间记忆，在隔核局部注射8-OH-DPAT所诱发的作用可被5-HT1A受体拮抗剂阻断，而5-HT7受体拮抗剂并未发挥作用[19]，提示了8-OH-DPAT对大鼠工作记忆的作用是由5-HT1A受体介导的，而非5-HT7受体。

同时，本研究还发现MS-DB局部注射WAY100635改善PD模型大鼠的工作记忆。WAY100635是一种选择性5-HT1A受体拮抗剂，对5-HT1A受体具有高度亲和力。本研究与MADJID等[20]的发现一致，即阻断5-HT1A受体可增强小鼠的学习能力。这一结果恰好可以用本研究的电生理学实验结果进行解释，即WAY100635可以诱发海马theta节律，并使theta节律的峰频率升高，而theta节律又与记忆能力呈正相关。

本研究结果显示，单侧MFB损毁损害大鼠的工作记忆，这与海马theta节律的活动减弱有关。阻断MS-DB中的5-HT1A受体可改善PD模型大鼠的工作记忆，这是通过兴奋海马theta节律实现的。提示MS-DB中5-HT1A受体参与了PD大鼠工作记忆的调节，为PD认知障碍的治疗提供了新的靶点。

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