星型胶质细胞代谢抑制剂氟代柠檬酸对大鼠蛛网膜下腔出血的保护作用及机制

行治国，赵君杰，宋锦宁，马旭东，黄廷钦，郭 丹

(1. 西安交通大学第一附属医院神经外科，陕西西安 710061；2. 渭南市中心医院神经外科，陕西渭南 714000)

蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)多由动脉瘤破裂引起，尽管目前蛛网膜下腔出血的病理生理研究和治疗取得了一定进展，但部分SAH患者的预后仍不理想。既往关于SAH的研究多集中在脑血管痉挛，但是越来越多的研究证实早期脑损伤(early brain injury, EBI)对SAH患者的预后起重要作用。EBI的机制主要包括：微循环及脑能量代谢、离子失衡、氧化应激等，其中免疫炎症也起重要作用[1]。星型胶质细胞是脑内胶质细胞的一种，能对中枢神经系统各种形式的损伤做出反应[2]。SAH后，星型胶质细胞逐渐活化，但其在炎症作用的角色仍未知。本研究拟建立大鼠SAH模型，通过给予星型胶质细胞代谢抑制剂氟代柠檬酸(fluorocitrate, FC)，检测大鼠皮层神经损伤、小胶质细胞活化、炎性因子-肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白介素1β(interleukin-1β, IL-1β)、白介素6(interleukin-6, IL-6)的水平、细胞核内核转录因子κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)的含量及其磷酸化程度、皮层细胞凋亡的变化，阐明星型胶质细胞的代谢抑制剂FC在SAH后炎症反应中的作用及机制。

1 材料与方法

1.1实验材料Iba-1抗体(日本Wako公司)、p-NF-κB抗体、NF-κB抗体、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)抗体购自美国Cell Signaling Technology公司，神经元核蛋白(neuronal nuclear protein, NeuN)抗体购自美国Millipore公司，神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase, NSE)抗体购自英国Abcam公司，氟代柠檬酸购自美国Sigma公司，兔SP免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术公司，TUNEL检测试剂盒购自美国Promega公司，TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA检测试剂盒购自美国R&D Systems公司，细胞核蛋白质提取试剂盒购自上海生工公司。

1.2实验动物与分组相同遗传背景的成年健康雄性大鼠36只，购自西安交通大学医学部实验动物中心，体质量280～320 g，饲养于标准环境(温度22 ℃，24 h昼夜循环光照，食水自由)。随机分为假手术组(12只)，SAH 3 d组(给予相同剂量生理盐水，12只)，SAH 3 d+FC组(12只)。FC浓度为20 nmol/L，造模后30 min内侧脑室注射10 μL[3]。本实验动物伦理经西安交通大学医学部生物伦理委员会批准。

1.3SAH模型制作所有大鼠术前常规禁食水6 h，用100 g/L的水合氯醛(4 mL/kg)腹腔注射进行麻醉。成功后将大鼠仰卧位固定于手术台，颈部剃毛、消毒。于颈部正中切开皮肤，逐层解剖，暴露右侧颈总动脉主干及分叉，继续向上分离颈内动脉和颈外动脉。动脉夹临时阻断颈总动脉及颈内动脉，丝线结扎颈外动脉远端并离断，将带有刻度的直径约0.265 mm的鱼线从颈外动脉残端置入颈内动脉，去掉颈内动脉夹，从分叉处插入深度约20 mm，感觉有阻力时再进线1～2 mm，刺破血管，维持15s后将线抽出，结扎颈外动脉，去除所有动脉夹，缝合切口[4]。

1.4大鼠侧脑室注射造模后30 min内行侧脑室注射，大鼠呈俯卧位，将大鼠头部固定于脑立体定位仪上，门齿杆-3.3 mm。头顶皮肤剃毛，消毒，于头正中做一长约1 cm切口，逐层分开肌肉、筋膜等，暴露前囟，以前囟点为0点寻找进针点，其坐标为AP：1.0 mm，L：1.5 mm，墨水标记。用牙科钻磨开颅骨，暴露硬脑膜，注射针垂直插入约4.5 mm，缓慢注射FC药物，持续约10 min，完成后注射针继续停留5 min，然后拔出注射针，骨蜡封闭骨窗，缝合头皮切口。SAH组给予相同剂量的生理盐水[5]。

1.5取材及组织病理学染色SAH 3 d后，麻醉大鼠，每组6只大鼠经生理盐水250 mL灌注取脑，分离皮层，脑组织置于液氮中保存。每组另6只大鼠经生理盐水及40 g/L的多聚甲醛各250 mL灌注取脑，并将脑组织放置在40 g/L的多聚甲醛中继续固定48 h。常规石蜡包埋、切片，片厚5 μm，60 ℃烤切片1 h，常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，标准步骤行HE染色，常规脱水、透明、封片。

1.6免疫组化及荧光观察Iba-1及GFAP的表达常规烤片、脱蜡、梯度乙醇水化；30 mL/L的H2O2消除内源性过氧化物酶；将切片浸入0.01 mol/L枸橼酸缓冲液，微波中最大火力加热至沸腾，冷却5 min，反复2次，自然冷却至室温；50 g/L BSA封闭；滴加一抗Iba-1(1∶400)；4℃过夜后，滴加二抗孵育，滴加SABC孵育，DAB显色，自来水冲洗干净；苏木素复染；梯度乙醇脱水，二甲苯透明，树胶封片，镜检。随机选5个视野用Image-Pro Plus软件分析测定阳性细胞数。免疫荧光染色步骤基本同免疫组化，一抗为GFAP(1∶300)、神经元核蛋白(neuronal nuclear protein, NeuN, 1∶400)、神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase, NSE, 1∶200)，4 ℃过夜后，滴加荧光二抗，DAPI复染，缓冲甘油封片，荧光显微镜观察、照相并分析。

1.7TUNEL法检测细胞凋亡切片常规二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化，2 mL/L的Triton X-100中浸润5 min，室温下平衡缓冲液中孵育10 min，然后37 ℃环境中TdT孵育60 min，PBS浸洗，终止反应，DAPI染核，荧光显微镜下观察凋亡细胞(绿色荧光)，随机5个视野统计凋亡细胞数[6]。

1.8电镜制片及观察将大鼠脑皮层置于电镜固定液中，按照常规电镜标本制作步骤，经清洗、脱水、浸透、包埋、修块后制作超薄切片，于透射电镜下观察并拍照。

1.9ELISA检测FC对炎性因子的影响将标准品和待测样品加入到原装包被的微孔板中，每孔100 μL，再于每孔加入50 μL的酶联亲和物，混匀后于37 ℃孵育1 h，倒掉孔内液体，洗涤液洗涤5次，每孔依次加入底物Ⅰ和底物Ⅱ各50 μL，混匀后避光反应15 min，再加入终止液终止反应，立即使用酶标仪测量。

1.10Westernblot检测细胞核内NF-κB含量及磷酸化程度按细胞核蛋白质提取试剂盒的说明书提取大鼠皮层细胞核的蛋白，按1∶4比例加入loading buffer，蛋白变性后，按每孔40 μg加入蛋白，电泳后转膜，并在50 mL/L脱脂牛奶中封闭1 h，过夜孵育一抗p-NF-κB(1∶1 000)、NF-κB(1∶1 000)，洗膜后孵育二抗，ECL显影，利用凝胶成像系统观察结果并拍照，Image J软件进行分析。

1.11大鼠神经行为学评分SAH大鼠评分依据Loeffler的5分制评分法：抓住大鼠背部，能正常运动并能5 s内翻身，评5分；自主运动减少，5 s内仍能翻身，评4分；翻身所需时间超过5 s，评3分；不能翻身，评2分；不能运动，评1分。

2 结 果

2.1SAH后大体标本及组织形态学改变大鼠SAH后，在蛛网膜下腔尤其是willis环附近出血较明显，但是假手术组则无出血，脑表面发白、干净。HE染色提示，假手术组皮层神经元形态结构正常，核圆，呈蓝色，胞质淡红。SAH 3 d后皮层的神经元肿胀，收缩变性，核变形、固缩、深染(图1)。

2.2FC改善SAH3d时的神经功能缺损大鼠SAH后均出现嗜睡、精神淡漠、活动减少、饮水和进食减少。假手术组活动正常，神经行为学评分为(4.99±0.01)；SAH 3 d组大鼠神经行为学评分明显降低(1.83±0.41)，而与SAH 3 d组相比，SAH 3 d+FC组的评分明显改善(3.45±1.02)。3组大鼠神经行为学评分差异有统计学意义(F=34.02，P=0.006)。

2.3FC减轻大鼠SAH3d后的神经损伤HE染色显示：与假手术组相比，SAH 3 d组皮层存在明显的神经元肿胀，收缩变性，核变形、固缩、深染；与SAH 3 d组相比，SAH 3 d+FC组皮层神经元肿胀程度，核变形、固缩、深染的程度均显著减轻(图2)。电镜结果显示：假手术组微血管结构完整，内皮形态规则，基底膜完整；SAH 3 d组微血管结构紊乱，内皮形态被破坏，基底膜不完整；与SAH 3 d组相比，SAH 3 d+FC组的微血管结构及内皮形态均趋于假手术组(图2)。免疫荧光显示：假手术组NSE阳性的神经元数量较少[(26.34±6.89)个/视野]；SAH 3 d组NSE阳性的神经元数量明显增多[(153.87±20.32)个/视野]，提示NSE的表达增加；与SAH 3 d组相比，SAH 3 d+FC组NSE阳性的神经元数量减少[(79.76±12.39)个/视野]。3组NSE阳性的神经元数量差异有统计学意义(F=45.32，P=0.005，图3)。

2.4FC减少SAH3d后皮层GFAP、Iba-1的表达免疫组化及Western blot的结果均表明：假手术组GFAP及Iba-1表达较少，SAH 3 d组皮层内GFAP及Iba-1的表达均明显增加，与SAH 3 d组相比，SAH 3 d+FC组皮层GFAP及Iba-1的表达均显著减少。3组的皮层GFAP及Iba-1的表达差异均有统计学意义(F=32.97，P=0.012，F=52.34，P=0.016，图4)。

图1 假手术组与SAH 3 d组脑组织的大体观察及皮层的形态学改变Fig.1 Gross and microscopic observation of brain tissue in sham and SAH 3 d groups (HE, ×200)

图2 FC减轻SAH大鼠的神经损伤Fig.2 FC attenuated brain damage after SAH (HE, ×200; electroscope, ×8 000)

2.5FC减少大鼠SAH3d后皮层的细胞凋亡为了阐明FC对皮层细胞凋亡的影响，利用TUNEL法检测凋亡细胞(绿色)，并利用DAPI染核(蓝色)，TUNEL与DAPI同时阳性的细胞定义为凋亡细胞。假手术组凋亡细胞较少[(10.76±5.23)个/视野]，SAH 3 d组凋亡细胞明显增加[(162.76±16.92)个/视野]，与SAH 3 d组相比，SAH 3 d+FC组的凋亡细胞数明显减少[(71.27±12.51)个/视野]。3组凋亡细胞数目差异有统计学意义(F=10.39，P=0.002，图5)。

2.6FC通过NF-κB信号通路减少炎性因子的释放为了阐明FC对大鼠SAH脑保护作用的机制，利用Western blot检测细胞核内NF-κB的表达变化及其磷酸化程度。与SAH 3 d组相比，SAH 3 d+FC组细胞核内NF-κB的表达及其磷酸化程度均减少。3组细胞核内NF-κB的表达及其磷酸化程度差异均有统计学意义(F=43.23，P=0.001，F=63.28，P=0.002，图6)。ELISA的结果表明：与假手术组相比，大鼠SAH后TNF-α、IL-1β、IL-6 3种炎症因子的水平均升高，与SAH 3 d组相比，SAH 3 d+FC组三种炎性因子的水平均有不同程度下降。3组中的TNF-α、IL-1β、IL-6水平差异均有统计学意义(F=61.62，P=0.011，F=82.11，P=0.020，F=26.83，P=0.023，图7)。

图3 FC减少大鼠SAH后皮层NSE的表达Fig.3 FC reduced the expression of NSE in rat cortex after SAH (IF, ×400)

图4 FC减少SAH后皮层GFAP、Iba-1的表达Fig.4 FC decreased the expressions of GFAP and Iba-1 in rat cortex after SAH (×400)

图5 FC减少SAH大鼠皮层的细胞凋亡Fig.5 FC alleviated the number of TUNEL-positive cells in rat cortex after SAH (×200)

图6 FC抑制大鼠SAH后皮层NF-κB的核转录及磷酸化水平Fig.6 FC inhibited the nuclear transcription and phosphorylation of NF-κB in rat cortex after SAH

图7 FC减少SAH后皮层炎性因子的含量Fig.7 FC reduced the levels of inflammatory factors in rat cortex after SAHP

3 讨 论

星型胶质细胞是中枢神经系统内数量最多的胶质细胞，既往认为其只对神经元提供结构、代谢及营养支持。随着研究的深入，发现其对中枢神经系统的炎性反应也有重要的调控作用，星型胶质细胞可通过释放细胞因子及趋化因子形成调控炎症反应的网络[7-8]。SAH会导致星型胶质细胞及小胶质细胞的激活，并导致促炎因子的释放[9]。因此，星型胶质细胞、小胶质细胞的活化参与SAH后早期脑损伤、迟发性脑缺血及功能缺损的整个过程。活化的星型胶质细胞介导的炎症反应是SAH后早期脑损伤的重要机制[2]。

FC是星型胶质细胞的代谢抑制剂，可减少GFAP的表达，抑制星型胶质细胞的活化[10]。既往研究证实，用FC抑制星型胶质细胞后，可有效减轻神经性病理痛[11-12]，也可抑制星型胶质细胞介导的缺血耐受[13]。本研究对SAH大鼠侧脑室注射FC，发现FC可减轻大鼠皮层神经元肿胀、核变形、核固缩，并使紊乱的微血管结构及内皮形态得到改善；NSE是神经元特异性烯醇化酶，其表达升高是SAH严重程度及预后的标志，FC也可以减少NSE的表达。此外，FC还可以改善大鼠SAH后的神经功能缺损，并减少凋亡细胞数量，提示FC可减轻SAH后的神经损伤。

FC的神经保护作用可能与其抑制NF-κB信号通路，减轻小胶质细胞活化，降低炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的水平有关。既往研究证实，SAH后患者脑脊液中的GFAP存在病理性升高，并且高峰也在出血后的24 h，此后逐渐降低，持续约两周。而SAH后没有存活的患者脑脊液中，其GFAP含量在脑血管痉挛的高峰期即出血后第6天出现第2个高峰[14]。SAH后48 h时，大脑皮层内TNF-α、IL-1β、IL-10、MCP-1、MIP2、CINC-1等诸多炎性因子的mRNA升高，并伴随着外周中性粒细胞的浸润。SAH后的21 d时脑组织内的炎症反应仍然存在，其特征就是小胶质细胞及星型胶质细胞的活化，并伴随着脑内灰白质的损伤[15]。SAH后7 d时，海马区有明显的星型胶质细胞活化[16]。因此，SAH后脑皮层内长期存在星型胶质细胞及小胶质细胞介导的炎症状态，并且炎症与SAH的严重程度明显相关。

NF-κB是细胞中重要的转录调节因子，生理状态下呈非活化状态，在多种刺激因子的作用下可发生活化，活化的NF-κB进入细胞核内与DNA结合，进而诱导多种基因的表达，产生多种细胞因子参与炎症反应。TNF-α、IL-1β、IL-6是常见的、重要的炎性因子，可由星型胶质细胞和小胶质细胞释放，受到NF-κB信号通路的调控，本研究中FC可通过抑制NF-κB信号通路减少三种炎性因子的产生和释放。此外，三种炎性因子由星型胶质细胞和小胶质细胞释放后，可以反过来激活星型胶质细胞和小胶质细胞，形成循环，导致炎性因子过度释放，对神经细胞造成损伤[17]。

综上，星型胶质细胞在SAH后早期脑损伤中发挥重要作用，其可能通过激活NF-κB信号通路，释放TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子，并激活小胶质细胞介导炎性损伤。FC可以抑制星型胶质细胞的过度活化，对SAH后早期脑保护有重要意义。

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