IL-25在支气管哮喘中的表达变化及其机制

汪 沛，何 娟，杨丽华，卢 佩，王刚强，李程华，杨若凡，郑善銮

(西京医院检验科，陕西西安 710032)

由于近年来环境污染的持续存在，哮喘的发病率居高不下，已成为严重危害国民身体健康的疾病之一，也是我国儿童常见的呼吸道疾病。目前哮喘的发病机制学说众多，但气道重塑是哮喘较为公认的病理改变之一。白细胞介素25(interleukin-25, IL-25)又称IL-17E，是重要的气道上皮细胞源性细胞因子，可参与哮喘的发生发展[1]。研究报道哮喘时患者血清中IL-25含量增加[2]，IL-25可促进原代大鼠气道平滑肌细胞的增殖活性，是导致气道重塑的重要因素之一[3]。但是哮喘患者及卵清白蛋白(ovalbumin, OVA)致敏的动物模型中IL-25表达增加的分子机制尚不明确。本研究在前期研究的基础上，以OVA致敏的哮喘大鼠模型和人支气管上皮细胞为研究对象，探讨IL-25表达增加的分子机制，明确表达调控的转录因子，为进一步阐明哮喘的发病机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1动物模型20只SPF级成年雌性Sprague Dawley(SD)大鼠购自空军军医大学动物中心(西安，中国)，大鼠可自由摄取食物和水。经适应性饲养1周 后，采用随机数字表将SD大鼠随机分为对照组和OVA组，OVA组大鼠皮下注射1 mL的2 g/L OVA(佐剂：100 g/L氢氧化铝)致敏大鼠，同时肌肉注射1 mL 百日咳杆菌。第14天起每天雾化OVA激发哮喘(10 g/L的OVA，20～30 min)，连续激发7 d。对照组小鼠以生理盐水替代处理。末次激发后处死大鼠，收集肺组织和血清，保存于-80 ℃冰箱用于后续实验。

1.2人支气管上皮细胞培养及处理人支气管上皮细胞系(BEAS-2B)购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库(上海，中国)，培养于含100 mL/L胎牛血清(Sigma，美国)的DMEM高糖培养基(Gibco，美国)。细胞生长至90%融合时，接种于细胞培养板中(Costar，美国)进行处理。探讨OVA对人支气管上皮细胞IL-25表达的影响时，采用系列质量浓度的OVA(0、0.1、0.3、1.0、3.0和10.0 μg/mL)处理人支气管上皮细胞，12 h后采用Trizol(Invitrogen，美国)收集细胞用于后续实验。探讨转录因子AP1在OVA诱导的人支气管上皮细胞IL-25表达中的作用时，AP1抑制剂(T-5224，10 μmol/L)预处理后再用OVA刺激人支气管上皮细胞[4]。

1.3Real-timePCR法检测IL-25mRNA表达取大鼠肺组织20 mg用液氮研磨成粉末后加1 mL Trizol充分裂解，细胞取Trizol保存的样本。采用酚氯仿法提取总RNA，当A260/A280在1.8～2.1之间可进行后续实验。取1 μg总RNA逆转录合成cDNA，运用Realtime PCR Master Mix(SYBR GREEN，Bio-Rad，美国)在CFX96 Touch荧光定量PCR检测系统(Bio-Rad，美国)进行检测。以GAPDH为内参，采用2-△△Ct法计算目的基因的相对表达量。本研究所采用的引物序列见表1。

表1 特异性引物序列表Tab.1 Sequence of primers used in this study

1.4酶联免疫吸附实验(ELISA)检测IL-25的表达采用ELISA试剂盒(R&D，美国)检测大鼠血清和人支气管上皮细胞培养上清液中IL-25的蛋白含量，严格按照试剂盒的说明书操作。

1.5Westernblot法检测转录因子AP1的表达细胞处理后采用RIPA(含蛋白酶抑制剂)收集总蛋白，取50 μg总蛋白于12%的SDS-PAGE凝胶中电泳，随后转至PVDF膜上，采用50 g/L脱脂牛奶封闭2 h后，4 ℃中孵育一抗过夜(1∶1 000，武汉三鹰，中国)。次日用TBST清洗未结合一抗后，室温孵育含HRP的二抗2 h(1∶50 000，Sigma，美国)。TBST清洗后ECL化学发光法检测蛋白条带。以GAPDH为内参进行相对定量。

1.6统计学分析用SPSS 18.0统计软件包进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差表示，两组间均数比较采用t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1两组大鼠肺内IL-25mRNA和血清IL-25蛋白表达的变化与对照组相比，OVA诱导的哮喘大鼠肺组织IL-25 mRNA表达增加，差异具有统计学意义，ELISA检测结果表明哮喘大鼠血清IL-25含量亦显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05，表2)。

表2 两组大鼠肺组织IL-25 mRNA和血清IL-25蛋白表达的变化Tab.2 The expressions of IL-25 mRNA and protein in the murine lungs of both groups of rats (n=10)

2.2OVA对人支气管上皮细胞IL-25表达的影响采用系列浓度OVA处理人支气管上皮细胞，ELISA法检测细胞培养上清液IL-25的含量，结果显示随着OVA含量的增加，人支气管上皮细胞分泌的IL-25含量逐渐增加，呈现剂量依赖性，当OVA的含量达到1 μg/mL 时IL-25的分泌达到平台期，故而后续研究采用该水平的OVA进行(图1)。

图1 OVA对人支气管上皮细胞上清液IL-25含量的影响Fig.1 The effect of OVA on the concentration of IL-25 in the supernatant of HBECs (n=4)

2.3OVA对人支气管上皮细胞AP1表达的影响Western blot检测结果显示，与对照组相比，OVA处理(1 μg/mL)的人支气管上皮细胞AP1蛋白表达增加，差异具有统计学意义(P<0.01，图2)。

图2 OVA对人支气管上皮细胞AP1蛋白表达的影响Fig.2 The effect of OVA on the expression of AP1 protein in HBECs (n=4)

2.4AP1结合位点的预测结果经网站预测在人类IL-25启动子区域存在5个AP1结合位点，具体序列信息见表3。

2.5AP1抑制剂对OVA诱导的人支气管上皮细胞IL-25表达的影响与对照组相比，OVA(1 μg/mL)可上调人支气管上皮细胞IL-25的分泌，而采用AP1抑制剂(T-5224，10 μmol/L)预处理30 min可部分逆转OVA诱导的IL-25的分泌，差异具有统计学意义(P<0.05，表4)。

表3 人IL-25启动子区域AP1结合位点预测结果Tab.3 Results of prediction of AP1 binding site in human IL-25 promoter

3 讨 论

哮喘又称支气管哮喘，是我国呼吸系统常见疾病之一，其发病机制复杂，目前远未完全阐明，近年来国家重大研究项目持续资助哮喘的基础与临床研究。前期研究证实，IL-25可促进大鼠原代气道平滑肌增殖，可能是IL-25加重气道重塑的分子机制之一[3]。其他研究者亦报道IL-25可通过多种机制参与哮喘的发生发展[5]。但哮喘时IL-25表达增加的分子机制尚未明确。本研究首次报道人支气管上皮细胞在遭受OVA刺激时可合成并分泌IL-25，并且其机制与OVA上调AP1的表达有关。进一步阐明了IL-25参与哮喘的分子机制，为开发以IL-25为靶点的哮喘治疗策略提供了实验依据。

支气管上皮细胞在哮喘的发生发展中具有重要作用。最新研究报道，气道上皮细胞是糖皮质激素治疗小鼠哮喘的重要靶细胞[6]，而哮喘时气道上皮细胞可分泌多种炎症因子和趋化因子，募集嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞等细胞[7]。已知支气管上皮细胞可分泌IL-25参与哮喘的发生发展[5]，本研究以人支气管上皮细胞为研究对象，体外实验证实OVA可呈剂量依赖性上调IL-25的合成与分泌。进一步证实上皮细胞来源的IL-25是哮喘的重要致病机制之一。OVA是外源性抗原物质，一般用于哮喘整体动物的构建[3,8-9]，本研究发现，OVA在体外研究亦可刺激支气管上皮细胞分泌IL-25，具有生物活性。国内亦有研究表明OVA在体外可刺激T淋巴细胞分泌IL-5[10]，表明OVA的体外研究是行之有效的方法。

AP1是重要的转录因子，可调控上皮的基因表达，AP1功能异常可改变角质细胞的增殖和分化[11]，同时AP1也参与上皮细胞的多种生理病理过程，例如TGF上调MMP9的表达是AP1依赖性的[12]。本研究通过网站预测发现在人支气管上皮细胞的启动子区域存在5个AP1的结合位点，强烈提示AP1是调控人支气管上皮细胞IL-25表达的重要转录因子。而抑制AP1的转录活性可部分逆转OVA诱导的IL-25分泌，提示AP1参与了哮喘时气道上皮细胞IL-25的合成与分泌。

综上所述，本研究首次报道OVA可促进支气管上皮细胞合成与分泌IL-25，后者可能通过旁分泌方式促进气道平滑肌细胞增殖，参与气道重塑。同时发现AP1是OVA诱导IL-25表达的重要转录因子。本研究为开发以IL-25为靶点的哮喘治疗策略提供了实验依据。

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