白藜芦醇通过TGF-β1/Smad3信号通路抑制心肌成纤维细胞中AngⅡ诱导的 Ⅰ/Ⅲ 型胶原合成

卓小桢，刘 懿，李 娜，尹晶晶，习 文，刘军辉,

(西安交通大学第一附属医院：1. 心血管内科；2. 检验科，陕西西安 710061)

心肌纤维化(myocardial fibrosis, MF)可由多种疾病导致，其基本的病理变化是心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts, CFs)的过量增殖，同时伴有细胞外基质(extracellular matrixc, ECM)过量积聚，不断发展可导致心脏结构的改变，心脏顺应性下降和舒缩功能减低。常见的心肌纤维化原发病有高血压、糖尿病、心肌梗死、扩张性心肌病等。长期慢性的高血压损伤可不断重构心脏原本健康高效的组织结构，而CFs的增生和ECM增多是大多数纤维化的具体病理表现[1]。形成高血压相关MF的机制较为复杂，和多种细胞生长因子和炎症因子的调控相关[2]。在高血压MF形成过程中，转化生长因子β(transforming growth factor beta, TGF-β)的表达和分泌明显增多[3]。TGF-β的增加可促进与胶原相关的多种基因的表达，相关CFs被激活，使得胶原分泌量增多，进而导致心肌ECM合成、沉积增加。TGF-β通过提高Smads蛋白的磷酸化水平而完成相关信号通路的激活，将信号传导至细胞核内完成其相应的生物学效应[4-6]。这一信号通路与MF有着密切的关系，其信号通路的异常活化可导致多种器官的纤维化进程。

白藜芦醇(resveratrol, Res)化学名为3,4,5-三羟基-1,2-二苯乙烯，是一种天然的含有芪类结构的非黄酮类多酚类化合物，主要存在于葡萄和虎杖等植物的茎及种子中[7]。Res具有多种生物活性，在抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗血小板聚集、免疫调节等方面都发挥着重要作用[8]。研究发现，Res可抑制TNF-α、IL-6和TGF-β等因子在肺纤维化中的表达，并降低炎症介质的水平，缓解损伤，抑制间质纤维化，减少细胞外基质沉积，保护肺组织[9]。在心血管系统中，Res不但能够降低血糖，还可以减少心脏缺血和再灌注损伤所诱导的心肌梗死范围，在此基础上提高部分心室的功能；体外实验发现，Res可抑制由血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, AngⅡ)诱导的离体心肌细胞肥大[10]。这都提示Res在抗心肌纤维化中可能扮演着的重要角色。但是，关于Res在高血压导致的心肌纤维化过程中起什么样的作用，这一过程是否有TGF-β/Smads通路的参与等问题，目前尚未明确。本研究以CFs为实验对象，研究Res对高血压诱导的MF的抑制效果， 探讨TGF-β/Smads信号通路在Res抗纤维化过程中的作用，阐明其可能的分子机制，为寻找心肌纤维化新的治疗靶点奠定基础。

1 材料与方法

1.1细胞鉴定与培养以Langendorf法逆行灌注急性酶解分离Wistar大鼠(3～5周龄)CFs[11]，用免疫荧光化学染色法验证分离的细胞中是否存在vimentin抗原的表达，通过细胞形态学和细胞中vimentin抗原的存在与否来鉴定分离的细胞是否为CFs。以分离培养的第2～8代CFs为研究对象，采用DMEM培养基、DMEM培养基+2 μmol/L AngⅡ、DMEM培养基+2 μmol/L AngⅡ+50 μmol/L Res不同条件干预，测定相关指标。

1.2主要试剂DMEM培养基购自美国Gibco公司，含100 mL/L胎牛血清(美国Hyclone公司)；100 IU/mL青霉素和100 μg/mL链霉素(美国Sigma公司)；白藜芦醇、二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司；Ⅰ型胶原抗体(ab90395)和Ⅲ型胶原抗体(ab7778)购自英国Abcam公司；Smad-3抗体(9513s)和P-Smad-3抗体(ser423/425)(9520s)均购自美国CST公司；TGF-β1抗体(sc-31609)，β-actin (sc-47778)购自美国Santa Cruz生物科技公司。

1.3Real-timePCR检测CFs中Ⅰ型胶原(CollagenⅠ)、Ⅲ型胶原(CollagenⅢ)及TGF-β1mRNA的表达

RNA fast200(上海飞捷，中国)试剂盒提取CFs中总RNA，使用PrimeScript逆转录试剂盒(TaKaRa公司，中国)反转录为cDNA，以cDNA为模板通过SYBR PrimeScript RT-PCR试剂盒(TaKaRa公司，中国)进行Real-time PCR反应。PCR反应条件及过程：预变性94 ℃ 4 min；单次循环的条件及过程：变性94 ℃ 30 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，共40个循环，以β-actin作为对照，用比较Ct法分析基因表达的相对变化。相关引物序列信息见表1。所有操作按照说明书进行。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.4Westernblot技术检测CFs中不同蛋白的表达使用RIPA裂解液(碧云天，中国)提取细胞总蛋白，BCA试剂盒(碧云天，中国)测定蛋白总浓度；细胞蛋白在100 g/L SDS-PAGE凝胶上进行电泳，电转膜法将蛋白质转移至PVDF膜，封闭阻断后，用一抗对膜进行免疫印迹，4 ℃静置过夜，在室温下将膜与HRP标记的二抗杂交1 h，用增强化学发光法测定蛋白表达；使用Image-J软件分析目的条带的累积灰度值，并与内参β-actin比较。所有操作按照说明书进行。

1.5ELISA法检测CFs培养液上清中可溶性CollagenⅠ和TGF-β1蛋白水平取细胞培养液，3 000 r/min离心5 min，取上清。所有操作按照说明书进行。

1.6统计学分析采用SPSS 13.0软件行统计学分析。所有实验重复3次及以上。统计数据以均数±标准差表示。两两比较采用Student’st检验，多组间比较采用方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1CFs的形态特征及鉴定光镜下可见细胞排列紧密，有的交叉重叠生长。与心肌细胞不同，CFs呈梭形，胞体较大，细胞质透明，细胞核较大，呈椭圆形，通常含2～3个核，无自发性搏动(图1)。免疫荧光染色镜下可见，细胞质内有红色细荧光颗粒染色的阳性信号，细胞核染色为天蓝色，表明胞质内vimentin抗原表达明显，证明实验所获得的细胞就是CFs(图2)。

图1 CFs的形态Fig.1 Morphology of myocardial fibroblasts (×200)

图2 CFs中vimentin抗原的表达情况Fig.2 Expression of vimentin in myocardial fibroblasts (×200)

2.2Res抑制CFs中AngⅡ诱导的胶原产生采用Real-time PCR检测AngⅡ及Res对Ⅰ型及Ⅲ型胶原mRNA表达的影响，结果显示，与对照组比较，AngⅡ干预显著促进CFs中Ⅰ型及Ⅲ型胶原mRNA表达(P<0.05)，Res显著抑制AngⅡ诱导的Ⅰ型及Ⅲ型胶原mRNA表达(P<0.05，图3A)。提示Res抑制了AngⅡ诱导的Ⅰ型及Ⅲ型胶原mRNA的转录。免疫印迹方法检测AngⅡ及Res对Ⅰ型及Ⅲ型胶原蛋白表达的影响，结果显示，与对照组比较，AngⅡ显著促进CFs中Ⅰ型及Ⅲ型胶原蛋白表达(P<0.05)，Res显著抑制AngⅡ诱导的Ⅰ型及Ⅲ型胶原蛋白表达(P<0.05，图3B)。由于胶原蛋白属于分泌型蛋白，合成后将转运至细胞外参与细胞外基质的构成，为此进一步检测了培养基中Ⅰ型胶原蛋白浓度。结果发现，AngⅡ的干预可以显著提高培养基中的Ⅰ型胶原水平(P<0.05)，在加入了Res后AngⅡ对Ⅰ型胶原的诱导作用被明显抑制(P<0.05，图3C)。

图3 Res抑制CFs中AngⅡ诱导的胶原产生Fig.3 Res inhibited AngⅡ-induced collagen produc-tion in CFs

2.3Res抑制CFs中AngⅡ诱导的TGF-β1表达和Smad-3的磷酸化采用Real-time PCR检测AngⅡ及Res对TGF-β1 mRNA表达的影响。结果显示，与对照组比较，AngⅡ显著促进CFs中TGF-β1 mRNA表达(P<0.05)，Res显著抑制AngⅡ诱导的TGF-β1 mRNA表达(P<0.05，图4A)。免疫印迹方法检测AngⅡ及Res对TGF-β1蛋白表达和Smad-3磷酸化水平的影响。结果显示，与对照组比较，AngⅡ干预显著促进CFs中TGF-β1蛋白表达(P<0.05)，Res显著抑制AngⅡ诱导的TGF-β1蛋白表达(P<0.05)；与对照组比较，AngⅡ干预显著促进CFs中Smad-3磷酸化水平(P<0.05)，Res显著抑制AngⅡ诱导的Smad-3磷酸化(P<0.05)；各种干预对Smad-3蛋白表达水平无显著影响(图4C)。采用ELISA方法检测培养基上清中TGF-β1的含量，分析AngⅡ及Res对其分泌水平的影响。结果显示，AngⅡ干预组培养基上清中TGF-β1含量显著高于对照组(P<0.05)，于AngⅡ干预组中加入Res，TGF-β1含量较高AngⅡ干预组明显降低(P<0.05，图4B)。

3 讨 论

高血压是引发MF主要原因之一。在高血压相关MF发生的同时会造成不同程度的交感神经兴奋，从而促进体内AngⅡ的合成与分泌，AngⅡ可直接诱导CFs的增殖和Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达。AngⅡ和醛固酮同时作用于CFs可呈协同效应，即联合作用强于AngⅡ和醛固酮单独促心肌纤维化作用[12]。为了探究Res在以上病理过程中的意义，本研究用AngⅡ干预CFs，发现其可以显著促进CFs中Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA和蛋白表达；在培养基中加入Res，发现其显著抑制了AngⅡ诱导的Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA和蛋白表达；同时，Res可以逆转AngⅡ诱导的Ⅰ型胶原蛋白分泌的增多。提示Res在转录水平抑制了AngⅡ诱导的Ⅰ型及Ⅲ型胶原mRNA的表达，最终导致了Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达和分泌水平的变化。

图4 Res抑制CFs中AngⅡ诱导的TGF-β1表达和Smad-3的磷酸化Fig.4 Res inhibited AngⅡ-induced TGF-β1 expression and Smad-3 phosphorylation in CFs

在高血压MF形成过程中，TGF-β是与高血压MF的形成关系最密切的细胞因子之一。TGF-β/Smads信号通路与MF有着密切的关系，其异常活化参与了人类多种脏器纤维化的发病过程[13]。本研究发现，在CFs中，Res可以明显抑制AngⅡ诱导的TGF-β1 mRNA和蛋白表达及分泌水平的增加。TGF-β/Smads信号传导途径最终是靠Smads的磷酸化实现对下游蛋白表达及功能的调控。为了进一步探讨Res对TGF-β/Smads通路的具体作用，实验同步检测了Smad-3的磷酸化水平，发现Res显著抑制AngⅡ诱导的Smad-3磷酸化，而对Smad-3蛋白表达水平无显著影响。有研究表明，Res减缓纤维化的机制可能为减少氧化应激、降低炎症因子表达、激活Sirt1从而抑制Smad3乙酰化[14]。另有报道，在各种体内外试验的病理环境和细胞类型中，TGF-β1表达上调和激活是AngⅡ诱导的纤维化反应的主要原因之一[15]，而通过AngⅡ特异性拮抗剂或AngⅡ受体阻滞剂干预阻断AngⅡ的功能可以抑制TGF-β1的表达，从而预防心肌纤维化的发生[16]。越来越多的证据表明，AngⅡ不仅通过其在高血压中的作用，而且可以直接影响CFs的增殖和活化而促进心脏重塑[17]。

以上结果表明，Res可以抑制CFs中AngⅡ激活的纤维化过程，而这一过程是和TGF-β1/Smad3通路直接相关的，不但可以直接抑制TGF-β1的mRNA及蛋白的表达，而且可以影响Smad3蛋白的磷酸化水平从而达到最终效果。总之，本研究结果证实，在AngⅡ介导的心肌纤维化过程中，TGF-β1/Smad3信号具有举足轻重的作用。

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