马尾松树皮提取物对牙本质小管的封闭效果及其耐磨损性能的体外研究

唐成芳，杨黎燕，曾 辉，马新扬，王 萌，李经纬

(1. 西安医学院口腔医学系，陕西西安 710021；2. 西安医学院药学院，陕西西安 710021；3. 西安交通大学口腔医院口腔颌面外科，陕西西安 710004)

牙本质敏感症(dentin hypersensitivity, DH)是牙齿遇到温度、化学、机械等刺激时，出现的一种一过性异常酸痛感觉，是最常见的牙体硬组织疾病之一[1]。DH的发生主要与牙本质小管呈开放状态密切相关，BRAENNSTROEM等[1-2]提出的液体动力学仍然是当前普遍接受的发病机制。据此，临床常通过封闭牙本质小管，从而降低牙本质通透性，减小牙本质小管内的液体流动治疗DH。因蜂胶、五倍子、地骨皮等天然物质安全无毒或低毒，并具有一定的胶原交联、凝固蛋白收敛止痛、封闭本质小管等功效，使应用中医药防治牙本质过敏日渐引起学者重视[3-5]。

马尾松树皮提取物(pinus massoniana bark extract, PMBE)是松科植物马尾松中提取的富含原花青素(procyanidins, PA)的黄酮类天然物质，结构中含有多个酚羟基，天然无毒，具有抗肿瘤、抗炎镇痛、胶原交联等生物活性[6-10]。因而，推测其可能具备一定的封闭牙本质小管和/或镇痛作用从而防治DH。前期，PMBE已被课题组证实可抑制牙本质脱矿、增强抗酸，从而预防牙本质过敏和防治根面龋[11]。本研究拟进一步观察前期优选浓度的PMBE乙醇溶液局部应用对暴露牙本质的即刻封闭效果及其耐磨损性，为临床应用其防治DH提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1主要材料和仪器PMBE(PA>95%，奥赛生物科技有限公司，西安)，无水乙醇(分析纯，西安化学试剂厂)，37%磷酸凝胶(DenFilTM，韩国)，柯伯脂氟保护漆(Puldent公司，美国)，氯化钙(CaCl2)、氯化钾(KCl)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、叠氮钠(NaN3，分析纯，国药集团化学试剂公司，上海)，牛血清蛋白(Sigma，美国)，羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES，Sigma，美国)。慢速切割机(UNIPOL-830，科晶有限公司，沈阳)，场发射扫描电镜(FESEM S-4800，Hitachi，日本)，电子分析天平(塞多利斯斯泰帝公司，德国)，恒温水浴箱(上海医疗器械厂，上海)。

1.2试样制备及溶液配制选取因阻生拔除的新鲜完整、无病变的第三磨牙于咬合面牙尖下2 mm和4 mm 处垂直于牙长轴切割，制备厚约2 mm的牙本质片，并进一步制备成长4 mm、宽3 mm、厚2 mm的牙本质块(图1)。每牙制备2块牙本质块，共制备70块。流水冲洗下打磨平整，清洗备用。

图1 试样制备Fig.1 The sketch of specimen preparation

每日按照以下配方新鲜配制人工唾液：1.5 mmol/L CaCl2、130 mmol/L KCl、0.9 mmol/L KH2PO4、20 mmol/L HEPES、1 mmol/L NaN3，添加20 g/L的牛血清蛋白，2 mol/L NaOH调pH至7.0。

无水乙醇为溶剂，配制80 g/L的PMBE液，静置过夜，取上清液备用。

1.3分组及处理

1.3.1分组 将70个试件采用随机数字表法随机分为7组(n=10)：乙醇空白、氟保护漆/即刻、氟保护漆/磨损7 d、氟保护漆/磨损14 d、PMBE/即刻、PMBE/磨损7 d和PMBE/磨损14 d组，乙醇空白组和氟保护漆各组分别作为阴性和阳性对照。

1.3.2牙本质过敏体外模型的建立 各组试件经超声清洗干净，用37%磷酸凝胶酸蚀30 s，蒸馏水冲洗3次，10 s/次，使牙本质小管呈开放状态模拟牙本质过敏的牙本质暴露和牙本质小管开放状态。

1.3.3牙本质小管封闭及磨损处理 乙醇空白组样本经气枪轻吹去除牙本质表面多余水分后用小毛刷取无水乙醇涂布2层共约2 min，自然干燥。

氟保护漆各组样本用气枪轻吹去除牙本质表面多余水分，用小毛刷均匀涂刷氟保护漆2层，自然干燥。氟保护漆/磨损7 d、氟保护漆/磨损14 d组自然干燥后，各样本单独放入1 mL的人工唾液并置于37 ℃恒温水浴锅中，早、晚7∶30取出进行刷牙磨损实验，刷牙时模拟bass刷牙的手法使刷毛与牙本质块表面呈45度角，并在原位做轻柔的水平颤动，水平移动距离约1 mm，同时在牙面涂抹摩擦剂，3 min/次，2次/日。每次刷牙完成后，去离子水彻底冲洗样本后，放回人工唾液中保存，人工唾液每日更换1次。其中，氟保护漆/磨损7 d组和氟保护漆/磨损14 d组样本分别磨损处理7 d和14 d。

PMBE各组样本用80 g/L PMBE乙醇溶液涂刷牙本质1次/d，2层/次共约2 min。PMBE/即刻组样本涂刷1次后，自然干燥。PMBE/磨损7 d和PMBE/磨损14 d组样本每次涂刷处理完成后，再按照氟保护漆组的方法进行刷牙磨耗，且分别处理7 d和14 d。为了保证磨损手法和力度的一致性，磨损实验均为同一人操作。

1.4表面及剖面形貌观察乙醇空白组、氟保护漆/即刻组及PMBE/即刻组样本涂布处理后均即刻自然干燥；其余各组样本磨损完成后自然干燥。所有样本沿制备的引导沟劈开分为两半，其中一半用于观察牙本质表面特征，另一半用于观察样本的纵剖面。样本喷金，FE-SEM观察表面牙本质小管封堵情况、剖面牙本质小管管腔形貌。

1.5牙本质小管开口面积、牙本质小管开口相对面积的测定采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件，对各组牙本质表面图像分别进行测量分析。导入采集图像，手动标记牙本质小管开口边界，测量牙本质小管开口面积(area of dentin tubule openings, ADTO)。按照公式计算牙本质小管开口相对百分面积(percentage area of dentin tubule openings, PADTO)：PADTO=(ADTO/牙本质面积)×100%。

1.6统计学分析采用SPSS 18.0统计软件对ADTO、PADTO等数据进行统计学分析，计量资料以均数±标准差表示，采用单因素方差分析并进行组间比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1表面及剖面形貌

2.1.1即刻组形貌观察 乙醇空白组牙本质小管口均开放，呈圆形或类圆形，剖面见牙本质小管管腔空虚无物，管壁较疏松多孔(图2A、A1)；氟保护漆/即刻组牙本质表面被覆膜状物，未见牙本质小管开口(图2B、B1)；剖面见管腔明显减小但未被完全封堵。管壁被覆厚薄不一的膜状物。

PMBE/即刻组牙本质表面牙本质小管口基本被完全封闭，仅个别牙本质小管不全封堵，剖面见自管口向下约3～4 μm长度的管腔被完全封堵，其余管壁致密(图2C、C1)。

图2 即刻组牙本质表面和剖面扫描电镜观察Fig.2 SEM micrograph of dentin surface and dentin profile in immediate groups

2.1.2磨损组形貌观察 PMBE磨损各组及氟保护漆磨损各组牙本质表面均可见明显刷痕，牙本质小管口部分开口，但开口程度小于乙醇空白组。氟保护漆/磨损7 d组牙本质小管处可见以牙本质小管为中心的圆形、类圆形或狭长的开口与开口外周环状致密组织构成的“同心圆状”磨耗(图3A)，剖面见牙本质小管壁的被覆物表面似有较小的致密颗粒形成(图3A1)；氟保护漆/磨损14 d组，牙本质表面刷痕更明显，小管开口数量和程度均明显增加，部分开口的小管腔内开口下方可见多少不一的封堵物(图3C)，剖面牙本质小管内见明显颗粒状或不规则团块状物形成(图3C1)。

PMBE/磨损7 d组牙本质表面呈现明显的浅凹陷状刷痕，致密的牙本质胶原纤维束清晰可见，牙本质小管大部分封闭，但小管开口数量和管径较PMBE/即刻组有少量增加，开口度和数量较氟保护漆组少(图3B)；PMBE/磨损14 d组牙本质表面浅凹形磨痕更加明显，小管开口度和数量增多(图3D)。PMBE/磨损剖面见牙本质管壁致密，部分小管的顶端有封闭物，7 d 组封闭物更致密(图3B1、D1)。

图3 磨损各组牙本质表面和剖面扫描电镜观察Fig.3 SEM micrograph of dentin surface and dentin profile in abrasion groups

2.2ADTO、PADTO结果如表1所示，ADTO及PADTO乙醇空白组最大，显著高于其余各组(P<0.05)。PMBE/即刻组ADTO及PADTO显著高于氟保护漆/即刻组(P<0.05)；氟保护漆/磨损14 d组和PMBE/磨损14 d组的ADTO及PADTO高于磨损7 d组，无统计学差异(P>0.05)，且均显著高于处理后即刻组(P<0.05)。PMBE/磨损7 d组和PMBE/磨损14 d组ADTO及PADTO与氟保护漆/磨损7 d组和氟保护漆/磨损14 d组基本相当，差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 各组ADTO、PADTO变化Tab.1 ADTO and PADTO in each group (n=10,

3 讨 论

DH是临床常见症状，其发病机制是目前广为接受的DH液体流动发病机制。该机制认为，外界刺激通过开放的牙本质小管引起牙本质小管内液体的异常流动，导致牙髓神经机械感受器被激惹，继而产生一过性疼痛，即DH[1-2]。因此，通过增加牙髓及牙本质神经纤维的疼痛阈值、降低神经纤维敏感性或机械的封闭牙本质小管来降低牙本质通透性被认为可缓解或消除牙本质过敏[12]。目前治疗DH的常用方法有激光脱敏法和氟化物、钾盐药物、Gluma脱敏剂及戊二醛、酚类等药物脱敏方法[12-14]。

戊二醛是一种化学交联灭菌剂，被单独用作治疗DH及作为市售Gluma脱敏剂中的有效成分，能使牙本质小管中的液体蛋白质变性、凝固，以封闭牙本质小管末梢，阻止小管液流动，从而达到有效脱敏作用。然而戊二醛具有一定腐蚀性、致敏性和致畸性[13,15]，因而本实验观察了天然、无毒的富含交联剂PA的马尾松树皮提取物封闭牙本质小管的功效及其耐磨性。

氟保护漆是以树脂为基质的含氟缓释剂，能在口腔内快速成膜，并持续释放氟离子的有机溶液，可封堵牙本质小管，对牙体组织具有良好保护作用，被临床用于龋病和牙本质过敏的预防和早期非手术治疗[15-6]。故本实验以热带树脂-柯伯脂为基质的氟保护漆为对照。ADTO及PADTO在本实验中代表视野中观察到的牙本质开口的实测面积和视野相对面积，可通过其值准确反映牙本质小管的封闭程度，其值越小，表明封堵效果越好，疗效越好。本研究结果表明，PMBE各组和氟保护漆各组ADTO及PADTO均显著低于乙醇空白组，80 g/L PMBE乙醇溶液与氟保护漆一样可有效封堵暴露牙本质的小管开口，从而阻止小管液流动。PMBE磨损各组的ADTO及PADTO均与氟保护漆磨损各组无统计学差异，两组的ADTO及PADTO均显著小于乙醇空白组。提示PMBE能有效封闭牙本质小管，每日局部短暂涂布应用显示出良好的耐磨性，且随时间变化无显著下降。EF-SEM结果也印证了上述结果。PMBE及氟保护漆磨损各组表面均见磨损痕迹，均有一定程度的磨损但牙本质表面开口明显较乙醇空白组小，剖面还可见小管内沉积物。有报道指出，即使牙本质小管直径变化很小，也会使小管内液体流动性大大减少，使牙本质敏感得到明显改善[12]。因此，被PMBE或氟保护漆保护的牙本质因刷牙磨损致使牙本质小管封闭效果减弱，但原理上小管内液体流动依然大大降低，因而还是能很大程度改善牙本质敏感的症状。

氟保护漆防治/改善牙本质敏感，并具有一定耐磨损性的机制，经分析主要基于以下两方面原因：一是所含热带柯伯树脂在口腔内快速成膜，即刻封堵牙本质小管；另外，牙本质表面和小管内形成的氟涂膜在口腔中缓慢释放氟，与牙本质或人工唾液中的钙反应，形成氟化钙或氟磷灰石，封堵、缩小牙本质小管管径，从而发挥隔绝或减弱外界刺激作用[16]。PMBE封闭牙本质小管和耐磨损性机制不同于氟保护漆，可能主要与其富含天然交联剂PA有关。一是富含PA的马尾松树皮提取物可改性脱矿牙本质，提高了硬度和弹性模量，从而增强耐磨性。研究发现，马尾松树皮和葡萄籽来源的分子式含多酚结构的天然交联剂PA与化学交联剂戊二醛一样可增加牙本质胶原交联度，提高牙本质的硬度、弹性模量和极限拉伸强度等机械性能[17-19]；二是原花青素、五倍子等多酚结构的物质可与蛋白质反应，从而凝固蛋白质使其变性[17]，因而从原理上PMBE也可使牙本质小管中的蛋白质变性、凝固，从而阻止小管内液体流动达到脱敏的目的；三是PMBE可因所含PA在人工唾液中促进了不全脱矿牙本质中的残余羟基磷灰石生长而再矿化[20]，进一步增强其耐磨性。此外，PMBE中还含有微量的钙元素和钼元素，可沉积于脱矿牙本质表面，从而增强牙本质[11]。

实验中PMBE溶液以乙醇作为溶剂，主要是因为乙醇无毒且具有较好的挥发性和渗透效果；PMBE采用局部每日1次涂布短暂处理，旨在后期能以漱口水或涂布剂的形式应用于临床，患者及医师简便易行；磨损实验中，由同一个实验人员每天对牙本质样本用bass刷牙手法进行2次为时3 min的磨损，避免了人为误差又模拟了口腔实际应用方式。因此，PMBE具有一定的临床应用潜力，本实验结果也具有一定的指导意义。

本实验证实，80 g/L PMBE短暂涂布处理牙本质可获得良好的牙本质小管即刻封闭效果和一定的耐磨性，从而治疗/缓解牙本质过敏。然而，本实验磨损时间仅仅2周，其封闭的长期持久性尚不明确；此外，具有镇痛功效的PMBE能否降低牙髓神经纤维敏感性还有待研究。

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