气管插管和口咽吸入两种方法吸入二乙酰构建闭塞性细支气管炎小鼠模型的比较研究

邓华蓉，龚财惠，袁小平，闫 莉，耿 刚，吴嘉彬，代继宏

(重庆医科大学附属儿童医院：1. 儿童发育疾病研究教育部重点实验室；2. 肺功能室；3. 呼吸中心一病房，重庆 400014)

闭塞性细支气管炎( bronchiolitis obliterans, BO)是气道炎性损伤所致的慢性呼吸道疾病，表现为小气道纤维增殖性病变使管腔狭窄，并最终闭塞，患者出现进行性、不可逆的气流受阻，严重威胁人类健康，尚无有效的防治手段，发病机制不清[1]。

构建简易的动物模型是研究BO发病机制及探讨治疗靶点的重要手段。目前，构建BO模型的方法主要有骨髓移植、肺移植、病毒感染及化学药物，上述的各种造模方法都存在一定优劣。针对不同病因引起的BO需要不同的动物模型。2002年《新英格兰杂志》报道爆米花工厂工人发生BO者，考虑与暴露于食品添加剂中的重要成分二乙酰(diacetyl, DA)有关，随后学者采用各种途径吸入DA的方法构建BO动物模型。本研究组前期利用口咽吸入DA的方法构建了C57BL/6小鼠的BO动物模型，但发现该方法存在模型不稳定、死亡率高、不易复制等缺点。近年有学者采用气管插管给予DA成功构建BO的大鼠模型。因此，本研究对口咽吸入和气管插管给予DA两种造模方法进行比较研究，以期探究出一种易于操作，成功率高的BO小鼠模型的构建方法。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组选取购于重庆医科大学实验动物研究中心6～8周清洁级雄性C57BL/6小鼠，小鼠饲养于重庆医科大学附属儿童医院实验动物研究中心SPF动物房；实验时室温(22±1)℃，湿度(47±2)%。实验操作均按照实验动物指南进行。SPF级C57BL/6雄性小鼠(6～8周)按随机数字表法分为4组：口咽吸入组(oropharyngeal aspiration, OPR)、气管插管组(intratracheal instillation, ITI)、口咽吸入对照组(OPR-CON)、气管插管对照组(ITI-CON)，每组10只，采用口咽吸入和气管插管一次性给予DA或蒸馏水(ddH2O) (400 mg/kg，327 mg/mL)后，饲养于SPF级动物中心，至第7天收集标本。每天于同一时间点观察小鼠一般情况及体质量至第7天，并做好记录。

1.2处理方法DA浓度的稀释：DA与ddH2O 1∶2混合，把原质量浓度981 mg/mL稀释为327 mg/mL。

OPR组：实验当天称体质量，100 g/L的水合氯醛(3 mL/kg)进行腹腔麻醉，实验员用左手固定住小鼠，右手用眼科镊子将小鼠的舌头从口中轻轻牵出，另外助手左手捏住小鼠鼻子，右手滴入DA(按400 mg/kg，327 mg/mL根据当日体质量计算)一次，动物清醒后，常规喂养。OPR-CON组：操作同OPR组，ddH2O代替DA。ITI-CON组：实验当天称体质量，100 g/L的水合氯醛(3 mL/kg)进行腹腔麻醉，固定于小鼠板上，用眼科镊子将小鼠的舌头从口中轻轻牵出，用自制的插管装置，在发光挖耳勺前置发光装置的引导下插入插管装置，拔出插管装置前的留置针，待小鼠呼吸平稳后缓慢滴入ddH2O(按400 mg/kg，327 mg/mL根据当日体质量计算)一次，动物清醒后，常规喂养。ITI组：操作同ITI-CON组，ddH2O代替DA。

1.3BALF的灌洗及细胞计数两种方法给药后 7 d 后，小鼠用100 g/L的水合氯醛麻醉，眼球取血处死，充分暴露气管和胸腔。用手术钳加紧左肺门，从气管插入留置针，拔出针芯并固定，灌入预先预冷的PBS，3次，每次0.5 mL，回收率大于80%证明灌注充分。2 500 r/min 4 ℃离心5 min，分装收集上清液。细胞沉渣用1 mL消毒后的PBS稀释，充分混匀后取20 μL进行细胞计数。剩余的2 500 r/min 4 ℃离心5 min，弃上清液，涂片，晾干后瑞氏染色细胞分类计数。

1.4肺功能测定第7天用无创肺功能体描仪行小鼠气道高反应性检测，先测定基础肺功能值，再将待检测小鼠依次雾化吸入乙酰甲胆碱(Mch)，由低质量浓度开始(0、3.125、6.25、12.5、25、50 mg/mL)，每个浓度雾化3 min、休息2 min，连续记录5 min取其平均值。用增强呼气间歇(enhanced pause, Penh)值代表雾化不同质量浓度乙酰甲胆碱后的气道高反应性。

1.5肺及肠组织HE染色、Masson染色及图像分析取4组小鼠左肺组织及肠道组织，置于100 g/L的中性甲醛中固定(至少大于24 h)，经脱水，石蜡包埋，切成4 μm的薄片，贴附在载薄片上，60 ℃烤箱内烘烤24 h后，分别行苏木精-伊红(HE)染色及Masson染色，光镜下观察病理改变。

2 结 果

2.1口咽吸入和气管插管给予美蓝后，美蓝在肺部的分布情况小鼠分别经口咽吸入和气管插管给予美蓝，可以观察到通过口咽吸入的方法，美蓝主要停留在气管，肺部分布不均匀，且一部分吸入到胃肠道，而气管插管给药可以看到，美蓝均匀分布在左右两肺，且未进入胃肠道(图1)。

图1 两种方式给予美蓝后肺和消化道的分布情况Fig.1 Distribution of methylene blue in the lung and digestive tract

2.2小鼠给药后的一般情况OPR组给予DA后，2 d后小鼠可见喘息、呼吸加快、抓口鼻、点头样等表现，4 d时上述症状缓解，但仍有呼吸加快、点头样呼吸等反应；OPR-CON组无以上症状。气管插管给予DA后，2 d后实验组小鼠可吼喘、呼吸加快、抓口鼻、点头样等表现，4 d时上述症状好转，但仍有呼吸加快、点头样呼吸等反应；ITI-CON组无以上症状。

2.3小鼠体质量的变化OPR组小鼠体质量于第1～2天下降最明显，从第3天开始体质量下降趋势减缓，但监测其体质量至第7天时仍低于OPR-CON组(P<0.001，图2)。ITI组小鼠体质量于第1～2天下降明显，从第3天开始体质量下降趋势减缓，第7天时气管插管组体质量低于ITI-CON组(P<0.001，图2)。OPR组体质量下降程度高于ITI组(P<0.001，图2)。

2.4各组小鼠的生存率及造模成功率实验过程中，OPR组观察至第7天时，共死亡6只，分别是第2天死亡1只，第3天死亡2只，第4天死亡2只，第5天死亡1只，剩余4只，有2只有明显病理改变，2只表现正常，至第7天时OPR组的生存率仅为40%(图3)，造模成功率为20%(明显病理改变数/每组小鼠的总数)。ITI组有3只死亡，分别死于第3天、5天、6天，剩余7只中的6只有明显的病理改变，1只无明显病理改变，至第7天时ITI组生存率为70%(图3)，造模成功率达60%。OPR-CON组和ITI-CON生存率100%。

图2 两种方法构建BO小鼠模型的体质量变化Fig.2 Weight change in two-method resulted BO murine model

2.5各组小鼠气道高反应变化OPR组与OPR-CON组相比，第7天肺功能(雾化Mch质量浓度为50 mg/mL时)Penh升高，差异有统计学意义(P<0.001，图4)。ITI组与ITI-CON组相比，第7天的肺功能(雾化Mch质量浓度为50 mg/mL时)Penh升高，差异有统计学意义(P<0.001，图4)。且ITI组(雾化Mch质量浓度为50 mg/mL时)Penh高于OPR组，差异具有统计学意义(P<0.001，图4)。ITI-CON组与OPR-CON组的肺功能无差异。

图3 两种方法构建BO小鼠模型的生存率Fig.3 Survival rate of two-method resulted BO murine model

图4 两种方法构建BO小鼠模型的肺功能改变Fig.4 Changes in lung function in two-method resulted BO murine model

2.6各组小鼠BALF中细胞总数及细胞分类计数BALF中炎症细胞总数及分类计数可见，第7天时OPR组和ITI组BALF中的细胞总数高于与对照组(P<0.001)，其中以中性粒细胞总数增高为主(P<0.001，图5)，且TIT细胞总数及中性粒细胞数高于OPR组(P<0.001，图5)，两对照组无统计学差异。

2.7各组小鼠肺组织病理学改变通过不同方式给予DA(400 mg/kg)1次后，HE染色可以看到两种给药方式都可以产生典型的BO病理改变。第7天时气管HE可以看到：OPR组气道上皮完整性破坏，出现异常的上皮增生，上皮下炎症细胞浸润(图6B)；ITI组气道上皮受损，管腔内出现肉芽样组织(图6D)。第7天时肺组织HE可以看到：OPR组小气道完全阻塞，上皮细胞脱落，肺出血，肺泡间隔增厚，管周大量炎症细胞浸润(图6F)；ITI组细支气管管腔阻塞，上皮细胞脱落，管周大量炎症细胞浸润，大气道出现肉芽样组织(未在图中展示)(图6H)。

图5 两种方法构建BO小鼠模型中BALF中炎症细胞Fig.5 Inflammatory cells in BALF of two-method resulted BO murine model

2.8Masson染色结果第7天时肺组织Masson染色显示OPR组和ITI组管周大量胶原蛋白沉积，出现类纤维化表现(图7)。

2.9造模组肠道病理改变OPR组，肠道HE显示肠道上皮脱落坏死，而ITI组及对照组(OPR-CON，ITI-CON)肠道形态正常(图8)。

3 讨 论

闭塞性细支气管炎(bronchiolitis obliterans, BO)是以进行性呼吸困难及气流受阻为表现的肺细支气管闭塞性疾病，早在1901年就有学者报道。本病是一个病理学概念，病理特征为细支气管及周围炎症、纤维增生，导致管腔闭塞[1-2]。目前BO的病因、发病机制还不清楚，深入探讨该病的发病机制、预防及治疗受到一定的限制。因此，构建适宜的动物模型是机制研究及探寻预防及治疗手段的重要研究方法。

导致BO的病因较多，如器官移植后(尤其是心、肺移植，骨髓移植等)、感染、吸入有毒有害气体等。据此，目前构建BO动物模型的方法包括异位/原位气管移植[3-4]、异位/原位肺移植[3-4]、造血干细胞移植[5]、持续高频雾化吸入化学或有毒物质(如DA、萘、氯气，二氧化硫)[6]等。基于移植的动物模型需要的技术条件较高，且移植后的BO模型和其他原因导致BO模型发病机制存在差异[7]。因此，建立适宜的非移植后BO模型对BO的机制研究具有重要意义。

图6 各对照组与造模组第7天的气管和肺组织病理改变Fig.6 Histopathological changes in two-method resulted BO murine model (HE, ×200)

图7 两种方法构建的BO小鼠模型第7天出现的类纤维化表现Fig.7 Airway fibrosis of two-method resulted BO murine model (blue: collagen, ×200)

图8 两种方法构建的BO小鼠模型肠道的病理改变Fig.8 Histopathological changes of the intestine in two-method resulted BO murine model (HE, ×200)

吸入有毒有害气体是导致BO的重要原因之一，如：文献报道国外爆米花工厂工人，长期吸入爆米花香味添加剂DA后，出现新发的、无法解释的阻塞性气流受限，被确诊为BO患者[8]。因此，通过气道给药方式制备的BO模型，更能为这类疾病的研究提供依据。文献报道，分别采用高频雾化吸入氯气或二氧化硫及二乙酰构建BO 模型中，因雾化过程中吸入有毒气体的多少存在个体差异，且雾化吸入化学物质污染环境，损坏病变主要在上呼吸道[9-11]。近年有学者在大鼠中采用气管插管的方法注入DA，成功构建BO模型[12]。相比雾化吸入，此方法造模更稳定，避免过度上呼吸道损伤，模型更接近临床的BO表现，但目前敲除鼠都采用遗传背景清楚的C57BL/6小鼠，给BO的研究带来限制。

在小鼠中采用气管插管的方法给予博来霉素已成功构建成熟的肺纤维化模型[13]。因此，本研究采用C57BL/6小鼠制备BO模型，该小鼠价格较低、遗传背景清楚、试剂来源广泛。本研究组前期利用口咽吸入DA的方法构建了C57BL/6小鼠的BO动物模型[14]。但该方法存在模型不稳定、死亡率高、不易复制等缺点。因此，本实验比较口咽吸入和气管插管两种给药方式，以期探讨出一种稳定地且易于构建的BO小鼠模型。

本实验发现，无论采用口咽吸入给药或气管插管给药造模，第7天后都可以出现气道高反应，BALF中炎症细胞数目增加，且以中性粒细胞浸润为主，HE染色显示气道管腔闭塞，上皮脱落，管周大量炎症细胞浸润，上皮下大量胶原物质沉积类纤维化等改变。

本实验还发现，采用口咽吸入给药小鼠模型不稳定，考虑与操作者的实验操作差异化较大有关，导致吸入DA的剂量不易控制。另外，本研究还发现，口咽吸入给药组小鼠体质量下降明显、生存率低，病理发现小鼠肠道上皮坏死，考虑为口咽吸入DA进入消化道所致。而气管插管保证了DA进入气道剂量恒定、均一，避免对消化道上皮的损伤。

因此，通过本实验可以得出采用气管插管一次性给予DA(400 mg/kg，327 mg/mL)，闭塞性细支气管炎小鼠模型建立良好，小鼠死亡率低，成功率高，值得实验推广使用。

参考文献：

[1] 中华医学会儿科学分会呼吸学组，《中华儿科杂志》编辑委员会. 儿童闭塞性细支气管炎的诊断与治疗建议[J]. 中华儿科杂志, 2012, 50(10):743-745.

[2] 赵德育，秦厚兵. 儿童闭塞性细支气管炎的研究现状[J]. 中华儿科杂志, 2011, 49(10):727-729.

[3] SATO M, KESHAVJEE S, LIU M, et al. Translational research: Animal models of obliterative bronchiolitis after lung transplantation[J]. Am J Transpl, 2009, 9(9):1981-1987.

[4] KUO E, BHARAT A, DHARMARAJAN S, et al. Animal models for bronchiolitis obliterans syndrome following human lung transplantation[J]. Immunol Res, 2005, 33(1):69-81.

[5] PANOSKALTSIS-MORTARI A, TRAM KV, PRIC AP, et al. A new murine model for bronchiolitis obliterans post-bone marrow transplant[J]. Am J Resp Crit Care, 2007, 176(7):713-723.

[6] BARKER AF, BERGERON A, ROM WN, et al. Obliterative bronchiolitis[J]. New Engl J Med, 2014, 370(19):1820-1828.

[7] SVETLECIC J, MOLTENI A, CHEN Y, et al. Transplant-related bronchiolitis obliterans (BOS) demonstrates unique cytokine profiles compared to toxicant-induced BOS[J]. Exp Mol Pathol, 2005, 79(3):198-205.

[8] KREISS K, GOMAA A, KULLMAN G, et al. Clinical bronchiolitis obliterans in workers at a microwave-popcorn plant[J]. New Engl J Med, 2002, 347(5):330-338.

[9] O’KOREN EG, HOGAN B LM, GUNN MD, et al. Loss of basal cells precedes bronchiolitis obliterans-like pathological changes in a murine model of chlorine gas inhalation[J]. Am J Resp Cell Mol, 2013, 49(5):788-797.

[10] MCGRAW MD, RIOUX JS, GARLICK RB, et al. Impaired proliferation and differentiation of the conducting airway epithelium associated with bronchiolitis obliterans after sulfur mustard inhalation injury in rats[J]. Toxicol Sci, 2017, 157(2):399-409.

[11] MORGAN DL, FLAKE GP, KIRBY PJ, et al. Respiratory toxicity of diacetyl in C57BL/6 mice[J]. Toxicol Sci, 2008, 103(1):169-180.

[12] PALMER SM, FLAKE GP, KELLY FL, et al. Severe airway epithelial injury, aberrant repair and bronchiolitis obliterans develops after diacetyl instillation in rats[J]. PLoS One, 2011, 6(3):e17644.

[13] MOELLER A, ASK K, WARBURTON D, et al. The bleomycin animal model: A useful tool to investigate treatment options for idiopathic pulmonary fibrosis?[J]. Int J Biochem Cell B, 2008, 40(3):362-382.

[14] 李松，张素倩，邹琳，等. 闭塞性细支气管炎小鼠模型的建立与评价[J]. 第三军医大学学报, 2014, 36(22):2283-2286.