携带3xflag 基因的重组水痘带状疱疹病毒的构建

张 科，王立新，于 魁，张 放，李 冀，刘爱华，李淑英

(1. 华北理工大学，河北省慢性疾病重点实验室，唐山市慢性病临床基础研究重点实验室，河北唐山 063210；2. 唐山市丰润区市场监督管理局，唐山市丰润区食品监督管理所，河北唐山 064000)

细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome, BAC)的发展是病毒突变领域的一项重大突破，为克隆大段DNA病毒提供了极大方便[1-3]。以GalK为基础的选择与反选构建重组病毒，为病毒基因突变提供了便利方法[4]。3xflag标记含22个氨基酸残基，具有高度免疫灵敏性，通常位于融合蛋白的外表面，便于目的蛋白的检测和纯化；含有3xflag融合蛋白的检测灵敏度高于其他系统[5-8]。本研究利用GalK为基础的同源重组方法，将3xflag添加到水痘带状疱疹病毒(varicella-zoster virus, VZV)开放读码框(open reading frame, ORF)7，构建携带3xflag基因的重组VZV。

1 材料与方法

1.1材料E.coliSW102菌株及其电转化感受态细胞，质粒GalK(pGalK)，质粒3xflag(p3xflag)，野生型(wild type)VZV BAC DNA(VZVWTBAC)DNA，含有VZV全部基因组，荧光标记及氯霉素抗性，均为美国罗格斯大学新泽西医学院朱桦教授惠赠。

1.2制备含有VZVWTBAC的SW102细胞将5 μg VZVWTBAC DNA电转到50 μL SW102电感受态细胞，转移到1 mL LB培养液，32 ℃孵育1 h；离心，用1×M9液[4]洗涤沉淀2次，涂布于LB琼脂培养基(含有12.5 mg/mL的氯霉素)，32 ℃培养1 d后有克隆形成，挑选4个克隆，提取质粒DNA，用VZVWTORF7引物检测(Check Forward：5′-GATTGCACATCCCTTTGTGGC-3′；Check Reverse：5′-GCG-

TGGATTTGGTTCAACTG-3′)。并将其命名为SW102-VZVWTBAC。制备SW102-VZVWTBAC电感受态细胞，―80 ℃保存备用。

1.3PCR扩增带有VZVORF7左右同源臂的GalKPCR扩增GalK片段，反应体系(100 μL)：1×PCR buffer，3.0 mmol/L MgCl2，10 μmol/L dNTPs，4 UTaqDNA聚合酶，引物10 μmol/L(Forward，5′-GA-ATCGTCGGTTTGGAGGATTTATCCATAGTT-CAATACGTTGGAAAGCCAGTCAATCATGCC-TGTTGACAATTAATCATCGGCA-3′；Reverse，5′-GCTCTTCAGTTGGTATTCGAGCATATCCACATAAGCTGGCACACACCGTCTGTCAGCACT-GTCCTGCTCCTT-3′)，200 ng质粒GalK DNA。PCR循环反应如下：95 ℃ 15 min；然后31个循环95 ℃ 30 s；55 ℃ 30 s；72 ℃ 1.5 min；延伸72 ℃ 10 min，20 ℃保温。PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，切胶纯化。

1.4GalK基因插入VZVORF7将已纯化带有VZVORF7左右同源臂的GalK电转到SW102-VZVWTBAC感受态细胞，然后转移到含有1 mL LB培养液，在32 ℃摇床孵育1 h，离心，用1×M9液洗涤沉淀2次，取沉淀涂布于M63配制的GalK培养板[4]，32 ℃培养3 d后有克隆形成；挑选2个克隆，提取质粒DNA，PCR(所用引物Check Forward：5′-GATTGCACATCCCTTTGTGGC-3′；Check Reverse：5′-GCGTGGATTTGGTTCAACTG-3′，产物1 400 bp)检测GalK。将其命名为SW102-VZVORF7-GalK-BAC。制备其感受态细胞，-80 ℃储存备用。

1.53xflag代替GalK基因首先用带有50 bp VZVORF7左右同源臂的3xflag引物Forward：5′-GAATCGTCGGTTTGGAGGATTTATCCATAG-TTCAATACGTTGGAAAGCCAGTCAATCATG-ATGGACTACAAAGACCATGAC-3′；Reverse：5′-GCTCTTCAGTTGGTATTCGAGCATATCCACA-TAAGCTGGCACACACCGTCTGCTTGTCATCG-TCATCCTTG-3′(产物大小为169 bp)；质粒3xflag模板，PCR扩增3xflag，产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳后，切胶，回收纯化。

取约800 ng已纯化的VZVORF7-3xflag PCR产物，电转到 SW102-VZVORF7-GalK-BAC感受态细胞转移至1 mL LB培养液，32 ℃振摇4.5 h，离心，用1×M9液洗涤沉淀2次，将沉淀混悬于1 mL M9培养液中，再分别进行10倍及100倍稀释后涂布于M63配制[4]脱GalK培养板，32 ℃培养3 d，有克隆形成；挑选4个克隆，提取质粒DNA，PCR(所用引物Check Forward：5′-GATTGCACATCCCTTTGTGGC-3′；Check Reverse：5′-GCGTGGATTTGGTTCAACTG-3′；产物859 bp)。将其正确克隆命名为SW102-VZVORF7-3xflag-BAC。

1.6转染ARPE-19细胞接种于6孔反应板，置于37 ℃，50 mL/L CO2温箱中培养，待其汇合度生长为60%时，分别用SW102-VZVWTBAC和SW102-VZVORF7-3xflag-BAC质粒转染：分别取4.5 μg SW102-VZVWTBAC和SW102-VZVORF7-3xflag-BAC质粒置于2个1.5 mL EP管中(做好标记)，用无血清的DMEM稀释至150 μL。取18 μL转染试剂，用无血清的DMEM稀释至300 μL。平均分装到上述2个EP管中，混合均匀，室温放置20 min。将上述SW102-VZVWTBAC的混合物添加到6孔板(分别标记1、2、3、4、5、6)的第1、2孔，第3、4孔添加SW102-VZV ORF7-3xflag-BAC混合物，第5、6孔作为对照。24 h后更换细胞培养液；然后每2～3 d换液；显微镜下观察细胞生长状况。待细胞长满6孔板后，转移到10 cm培养皿培养，继续观察。

1.7转染细胞中3xflag的表达待10 cm培养皿细胞长满后，收集转染与未转染组细胞，分别提取细胞RNA及蛋白，用逆转录PCR和Western blot检测3xflag的表达状况。

2 结 果

2.1PCR扩增检测SW102-VZVWTBAC将所选克隆提取质粒DNA经PCR扩增后，得到产物大小为869 bp(图1)，与预期结果相一致，说明所选克隆是正确的，将其命名为SW102-VZVWTBAC。

图1 VZVWTBAC电转到SW102所选克隆进行PCR扩增后的电泳结果Fig.1 The electrophoresis results of PCR amplified for verification of VZVWTBAC cloned to SW102

2.2GalK插入VZVORF7GalK培养板筛选3 d后，将所选克隆提取质粒DNA，电泳检测到约1 589 bp的产物(图2)，所得片段大小与预期的结果相一致，表明GalK已克隆至VZVORF7。将其命名为SW102-VZVORF7-GalK-BAC。

图2 GalK电转到 SW102-VZVWTBAC所选克隆进行PCR扩增后的电泳结果Fig.2 The electrophoresis results of PCR amplification for verification of GalK electroporated to SW102-VZVWTBAC

2.33xflag替代GalK基因从脱GalK平板所选择的2个克隆，检测到大约859 bp的产物(图3)，所得片段大小与预期的结果相一致，表明3xflag已克隆至VZVORF7。将其命名为SW102-VZVORF7-3xflag-BAC。

2.4转染结果分别将 SW102-VZVWTBAC和SW012-VZVORF7-3xflag-BAC转染ARPE-19细胞，荧光显微镜下观察显示：3 d后可见带有绿色荧光的病毒斑块，15～20 d带有绿色荧光的病毒越来越多(图4)。将重组病毒命名为VZVORF7-3xflag。

图3 3xflag 电转至SW102-VZVORF7-GalK-BAC后所选克隆及转染细胞中VZVWTBAC与VZVORF7-3xflag-BAC的PCR扩增产物的电泳结果Fig.3 The electrophoresis results of PCR products for verification of 3xflag from the selected clones of electroporated to SW102-VZVORF7-GalK-BAC, and verification of VZVWTBAC and VZVORF7-3xflag-BAC from VZVWTBAC and VZVORF7-3xflag-BAC transfected ARPE-19 cells

图4 荧光显微镜观察SW102-VZVWTBAC和SW102-VZVORF7-3xflag-BAC转染ARPE-19细胞的生长状况Fig.4 Growing virus after SW102-VZVWTBAC and SW102-VZVORF7-3xflag-BAC transfected to ARPE-19

2.5VZVORF7-3xflag的表达情况将转染细胞培养大约20 d收集细胞，分别提取转染和未转染细胞RNA和蛋白，逆转录和Western blot检测3xflag表达状况，逆转录PCR产物约859 bp和948 bp，分别为SW102-VZVWT-BAC和SW012-VZVORF7-3xflag-BAC DNA转染结果(图3)；Western blot用抗ORF7鼠单克隆抗体检测SW102-VZVWT-BAC和SW012-VZVORF7-3xflag-BAC转染细胞，得到大约29 ku和30 ku蛋白(图5A)。flag表达系统是8个氨基酸组成的亲水性肽。flag肽位于融合蛋白的表面。3xflag系统是通过融合3个串联flag表位(22个氨基酸)对原始系统的改进，当与抗flag抗体结合时，1个抗体结合1个flag表位得到约1 ku条带，2个抗体结合2个flag表位得到约2 ku条带，2个抗体结合2个flag表位得到约3 ku条带。因此，用抗flag鼠单克隆抗体检测SW102-VZVWT-BAC和SW012-VZVORF7-3xflag-BAC转染的细胞得到大约1、2、3 ku蛋白(图5B)。

图5 Western blot检测VZVWT和VZV ORF7-3xflag感染ARPE-19细胞中ORF7及flag的表达状况Fig.5 Detection ORF7 and flag from VZVWT and VZV ORF7-3xflag infected ARPE-19 cells by Western blot

3 讨 论

实验诱变方法的进步为蛋白质结构、功能、发病机制、生物工程、疫苗的开发等提供了极大的方便[9-12]。传统的实验突变方法包括：插入突变、位点定向诱变及转座子突变等。这些传统的突变方法涉及到分子克隆所依赖的载体准备、待插入的DNA片段及连接等过程。用这些传统方法进行突变的程序不仅浪费了大量的时间，而且消耗了大量的体力劳动。

细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome, BAC)克隆技术在病毒突变方面是一项重大突破，这种技术克服了传统突变方法的缺点。病毒BAC克隆的病毒可在细菌细胞内保持稳定及传播，可容易地进行病毒基因组的操作，任何要求的病毒基因突变都可容易地利用病毒BAC克隆而取得。这种突变还可以在获得重组病毒之前加以验证。这种新方法对于重组病毒的结构及功能的研究提供了极大的方便[1,13-15]。

同源重组是基因重组的一种类型，是2个相同序列的DNA核苷酸之间进行交换。野生型大肠杆菌对诱导外源DNA的同源重组是无效的，因为线性DNA通常被RecBCD核酸外切酶降解。SW102菌株包含1个温度敏感的λ噬菌体编码的1个暂时抑制RecBCD(gam)的基因，以及2个基因(exo和beta)在同源重组过程中进行双链的损伤修复[15]。λ噬菌体对温度敏感(由于1个温度敏感λcI抑制子的表达)，当细胞培养温度从32 ℃增加到42 ℃时，线性DNA的摄取和重组可以在几分钟内完成[15]。这样，当细菌细胞在32 ℃正常生长时，可以有几千个碱基对进行同源重组。另外，改良的温度敏感的λ噬菌体要求的同源重组发生在同源序列相对较窄的一个区域内，因为BAC突变体的建立通常是使用PCR扩增的基因序列，其两侧应为约40个碱基对与病毒DNA BAC序列同源[3]。

为进一步探讨GalK为基础的基因重组突变方法，本实验将3xflag作为融合表达目标蛋白添加到VZV ORF7构建重组病毒的方法，结果显示：使用flag作为标签，与靶蛋白ORF7融合表达具有以下优点：首先，flag通常不与靶蛋白ORF7相互作用，也不影响ORF7的功能或性质；因此，可以通过融合蛋白探讨靶蛋白ORF7的功能；第二，flag融合靶蛋白可以非变性纯化，有效纯化活性融合蛋白。第三，flag标签蛋白可以被抗flag抗体识别，并且容易通过Western印迹方法检测或鉴定。将3xflag与ORF7融合表达，可以有效地增强ORF7的表达水平，为进一步探讨ORF7功能研究奠定基础；同时利用细菌人工人染色体作为载体，通过GalK选择，反向选择及同源重组方法，构建了携带3xflag基因的重组VZV，表明通过GalK为基础的同源重组，可方便、快捷并准确地对感兴趣的病毒基因进行操作。

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