结合吸烟与遗传因素交互作用鉴定骨质疏松症易感基因

杨 波，陈晓峰，段媛媛，郭 燕

(1. 陕西省人民医院骨科，陕西西安 710068；2. 西安交通大学生命科学与技术学院，生物医学信息工程教育部重点实验室，陕西西安 710049)

骨质疏松症(osteoporosis, OP)是以骨量减少、骨质量受损及骨强度降低，导致骨脆性增加、易发生骨折为特征的全身性骨病[1]。该病是中老年人的常见病、多发病，其导致的骨折是中老年人致残、病死的主要原因。除年龄、绝经、疾病和药物等危险因素外，吸烟也是骨质疏松症发生的重要原因之一[2]。早在1976年，DANIELL等[3]研究表明，相比不吸烟者，女性吸烟者绝经后会出现更多的骨丢失(P<0.001)。吸烟已被证实为骨质疏松的主要危险因素之一，近期一项长期流行病调查显示：长期吸烟会显著增加骨疏松症发生风险[4]。研究证明，青年男性吸烟者的骨密度减少，导致其老年时期骨质疏松症风险显著增加[5]。然而目前并不清楚吸烟影响骨质疏松症的具体分子机制。

作为一种高通量全基因组基因表达定量技术，表达谱芯片已被广泛应用于多项生命科学研究领域[6-8]。然而传统的表达谱分析多关注于简单的病例对照差异表达分析，忽略了环境因素的影响，存在一定局限性[9]。对比而言，结合全基因组关联分析(Genome-wide association study, GWAS)进行全基因组基因环境互作分析已被证明为一种有效挖掘环境相关疾病风险基因的方法，现广泛应用于精神病、哮喘、帕金森、癌症等复杂疾病的研究[10-12]。然而，单纯的GWAS也存在假阳性率高、价格昂贵等问题。结合表达谱芯片和GWAS全基因组基因环境互作分析，克服了传统实验的弊端，立足于大数据挖掘，有助于挖掘基因与环境互作机制，阐明疾病发生机制，提供新的药物靶标。遗憾的是，结合表达谱芯片及GWAS的基因环境互作分析，目前并未见诸报道。此外，关于骨质疏松症和吸烟相关的基因环境互作分析也属于当前研究空白。

在本研究中，我们首次结合表达谱芯片和GWAS进行了吸烟与骨质疏松症互作分析，找出显著关联的风险基因，并通过通路富集分析挖掘潜在的致病通路，进一步验证了富集通路中的风险基因，最后对验证基因进行蛋白网络分析。这一整合分析方法有助于解密吸烟影响骨质疏松症风险的分子机制，为相关药物靶点开发提供新思路。

1 材料与方法

1.1材料本研究涉及表达谱芯片和基因芯片数据挖掘。其中，Affymetrix HG-U133A表达谱芯片(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/，GSE13850)记录了人外周血B细胞全基因组基因表达信息。共计40名高加索样本，其中包含20名高骨密度及20名低骨密度样本，高低骨密度样本组均分别包含10名吸烟和10名非吸烟样本。Affymatrix SNP 6.0基因型芯片(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gap，phs000390.v1.p1)包含1 617名高加索人基因型信息(909 622个单核苷酸多态性位点)，以及表型信息(髋部/脊椎骨密度、吸烟习惯、年龄、性别、身高、体质量)，该数据用于全基因组基因环境互作分析(详细统计见表1)。表达谱芯片和基因芯片数据是两个独立的数据集。

表1 GWAS样本统计Tab.1 Summary of GWAS samples

1.2方法

1.2.1表达谱芯片质量控制 对于表达谱芯片，采用R语言Bioconductor库(http://www.bioconductor.org/)相关包进行质控分析。首先，导入simpleAffy包(http://www.bioconductor.org/)并绘制质控总览图，该图包含质控探针actin和GAPDH的3′/5′荧光信号比值、尺度因子、嵌入探针BioB是否检出等关键质控指标。依据包参考标准(探针比值actin<3，GAPDH<1，尺度因子处于正常范围即输出图中蓝色标识区域，Bio能被检出)剔除检测指标异常的样本。其次，进一步导入affyPLM包(http://www.bioconductor.org/)并绘制相对对数表达箱线图(RLE)和相对标准差箱线图(NUSE)。如果RLE中位数接近0，NUSE中位数接近1时，证明样本数据均一性好，质量可靠。最后，通过绘制RNA降解曲线，评估RNA 5′～3′降解斜率(不宜过低)，考虑是否剔除降解严重的不可靠样本。

1.2.2双因素方差分析 表达谱芯片经过质控后，导入R语言affy包(http://www.bioconductor.org/)，读取原始数据，利用内置rma一体化算法，经过背景校正和归一化，获得转化后的特异性探针，即基因表达水平值。依据高低骨密度分组，传统的差异表达分析仅仅考虑了遗传因素对骨密度的影响。本研究中为了探索吸烟与遗传因素互作，我们把样本分为吸烟×高骨密度组、吸烟×低骨密度组、不吸烟×高骨密度组、及不吸烟×低骨密度组共计4组，采用双因素(吸烟/不吸烟；高/低骨密度)方差分析挖掘同时与吸烟及骨密度显著相关的易感基因。原始P值采用FDR方法校正。如果同一基因对应于多个探针，我们保留P值最小的探针代表相关基因。FDR<0.05为差异有统计学意义。区别于传统的差异基因表达分析，本研究旨在探索潜在的受吸烟(环境)调控，影响骨质疏松症患病风险的关键易感基因，解析潜在的吸烟影响骨质疏松症的分子遗传学机制。因此，本研究采用双因素方差分析，其中显著的互作基因(FDR<0.05)即为潜在的与吸烟互作的骨质疏松易感基因。

1.2.3通路富集分析 为了分析潜在的关键功能性基因及其参与的重要代谢通路，对于显著易感基因(FDR<0.05)，我们利用R软件，导入clusterProfiler包(http://www.bioconductor.org/)进行Disease Ontology(DO)，Rectome和KEGG通路富集分析，寻找潜在的与骨质疏松症相关生物代谢通路。采用BH方法校正原始P值。BH<0.05为差异有统计学意义。

1.2.4基因型芯片质量控制 对于SNP 6.0基因型芯片，样本基因型信息首先被转换成plink软件标准输入格式(http://pngu.mgh.harvard.edu/～purcell/plink/)，并利用该软件进行质控分析。质量控制分为样本水平和单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms, SNP)位点水平。其中，基因型检出率低于95%的样本被剔除。而最小等位基因频率低于5%，或不满足哈迪温伯格平衡(P<0.001)，或分型成功率低于95%的SNP也被剔除。

1.2.5基因环境互作分析验证通路富集基因 对于显著富集代谢通路(BH<0.05)，进一步利用基因环境互作分析验证潜在功能性基因。具体思路如下：基因型芯片经过质控后，生成新的plink格式文件(ped格式文件记录基因型信息；map格式文件记录SNP位点信息)，利用annovar软件(http://genome.ucsc.edu)对新map文件中的所有SNP位点进行基因注释(依据基因内含子，外显子或UTR区的SNP)，保留注释基因为显著富集通路基因的SNP，生成新的plink格式文件，存储基因型信息。对于髋部和脊椎骨密度，分别利用R软件的lm函数，以年龄、身高、体质量、性别为协变量，进行多元回归分析，校正相关协变量对表型的影响，并以校正后的残差作为新表型。最后，利用plink软件进行基因环境互作分析(髋部或脊椎骨密度与吸烟互作)，进一步验证潜在的与吸烟互作的骨质疏松易感基因。P<0.05为差异有统计学意义。

1.2.6蛋白互作网络分析 为了进一步探索验证基因的潜在调控模型，我们利用STRING在线数据库(www.string-db.org/) 对与吸烟和骨质疏松症显著互作的基因进行网络分析，并提取被验证基因组成的子网络。

2 结 果

2.1双因素方差分析鉴定骨质疏松症与吸烟互作易感基因利用simpleAffy包直观显示质控总览图，结果显示，所有样本的内置质控探针actin和GAPDH的3′/5′比值均小于1，此外尺度因子均处于正常范围内，说明芯片质量良好，无需剔除特定样本。不同组别芯片大部分基因表达水平应该比较接近。相对对数表达箱线图(RLE)显示所有样本整体表达水平趋于一致(比值接近1，对数值接近0)，符合预期。此外，相对标准差(芯片基因标准差相对于全体标准差)箱线图(NUSE)显示所有样本基因表达标准差趋于一致(相对标准差接近于1)，表明芯片质量较好。RNA降解曲线分析显示所有样本5′端荧光强度均低于3′端，符合RNA一般从5′端到3′端降解的理论预期，降解曲线斜率均较小，说明没有降解严重的样本出现，进一步证明了芯片质量良好。

对于Affymetrix HG-U133A表达谱芯片，采用rma算法归一化处理后，总共获得19 916个探针的表达值，对应于12 747个基因。双因素方差分析显示，有4 053个潜在的与骨质疏松症和吸烟互作相关联的候选易感基因(P<0.05)。如图1所示，区别于方差分析方法，单独的吸烟或骨密度差异表达分析仅仅找出2 209个(54.5%)或657个(16.2%)重叠基因。如果对吸烟或骨密度单独进行差异表达分析，并取交集，结果显示更明显差异(9.0%重叠率)。这证明了双因素方差分析方法结果的特异性。经过FDR校正后，共有441个显著关联易感基因(FDR<0.05)。聚类分析显示，单独的吸烟或骨密度分组无法显示聚类易感基因，进一步验证这441个基因和吸烟及骨密度均存在显著关联(图2)。

2.2通路富集分析对显著关联的441个易感基因进行DO和KEGG通路富集分析，结果显示仅有间隙连接(gap junction)通路显著富集(BH校正，P<0.01，表2)。间隙连接通路中12个富集基因为：EGFR、GJD2、GNAI3、CSNK1D、ADCY9、GNA11、TUBAL3、MAPK7、LPAR1、PRKG1、TUBA1B、TUBA1C。这12个基因中有4个基因同时也参与了其他分子通路调节：ADCY9基因还参与了嘌呤代谢通路(purine metabolism)和促性腺激素释放激素信号通路(GnRH signaling pathway)；EGFR还参与了促性腺激素释放激素信号通路(GnRH signaling pathway)和粘附连接通路(adherens junction)；GNA11和MAPK7还参与了促性腺激素释放激素信号通路(GnRH signaling pathway)。这提示4个基因具有广泛的分子调节功能，可能在疾病发生与发展中起关键作用。此外，通路分析显示大量基因参与了骨相关的代谢通路(表2)，其中包括经典的MAPK通路(10个基因)，Wnt信号通路(5个基因)，成骨细胞分化通路(4个基因)，骨疾病(30个基因)，骨炎症疾病(29个基因)，骨重塑疾病(5个基因)，骨吸收疾病(3个基因)，骨关节炎(6个基因)，骨质疏松(3个基因)，骨硬化病(3个基因)。

图1 双因素方差分析与传统分析方法的结果比较Fig.1 Comparison between two-way ANOVA analysis and traditional analysis

2.3基因环境互作分析验证通路基因根据质控标准，26个不满足检出率大于95%的样本(整体检出率为98.8%)被剔除，41 905个分型成功率小于95%，203 991个最小等位基因频率小于5%，以及3 564个不满足哈迪温伯格平衡(hwe>0.001)，共计204 973个SNP被剔除。经过质量控制后，GWAS数据包含1 209名女性，659 180个SNPs探针数据。

利用Annovar软件对659 180个SNP进行基因注释，发现其中6 360个SNP定位于外显子，5 903个SNP定位于UTR区，259 913个SNP定位于内含子区(30个可能影响可变剪切)。总计272 176个SNP能被注释到16 623个基因。我们对显著富集的通路(间隙链接)及骨相关通路(表2)的所有基因进行注释，发现共有1 027个SNP(其中1 008个SNP位于内含子，7个位于外显子，12个位于UTR区)能被注释到37个基因。此外，有25个SNP注释到20个基因启动子区。启动子变异对于基因表达调控发挥重要作用。

图2 441个易感基因表达热图Fig.2 Heat map of 441 susceptibility genes

表2 显著富集或骨相关代谢通路富集分析结果Tab.2 Results of bone metabolism functional enrichment analysis

对表型(髋部骨密度、脊椎骨密度)进行协变量(年龄、性别、身高、体质量)校正后，我们分别对髋部和脊椎骨密度进行基因环境(吸烟×骨密度)互作分析。结果发现，在髋部和脊椎骨密度上分别有10个和11个SNP显著差异(P<0.05)，对应于10个基因和11个基因(表3)。两种表型中均能被验证的为DDR2、ITGA9、EGFR、MSR1、IL7、PRKG1、ADCY9共7个 基因，其中EGFR、CFTR、LRP6基因均参与了多种重要代谢通路(表2)，表明这3个基因具有重要的生物功能。

2.4蛋白网络分析我们首先分析了14个验证基因潜在的功能。如图3A所示，通路分析显示有8个潜在基因与骨疾病相关 (BTNL2、CFTR、DDR2、HGD、IL7、ITGA9、LRP6、MSR1)，5个基因与免疫相关 (PRKG1、EGFR、IL7、PRKG1、ADCY9)，2个基因参与了骨代谢的经典通路：Wnt信号通路 (WNT16、LRP6)，5个基因参与了炎症感染相关通路(ADCY9、WNT16、SRF、EGFR、ITGA9)。我们进一步对上述14个验证基因进行蛋白网络分析，结果发现，除BTNL2基因作用比较孤立外，其他13个差异基因间存在显著互作，构成1个复杂的调控子网络(图3B)。这提示EGFR、PRKG1、CFTR、LRP6和ADCY9等13个基因可能发挥着广泛的生物学调控功能，其参与的调控子网络可能受吸烟因素影响，进而对骨质疏松症相关代谢发挥重要调控作用。

3 讨 论

传统分子生物学实验多聚焦于探索单一因素对疾病的影响(如基因表达影响疾病)。然而越来越多的研究表明环境因素对复杂代谢类疾病，如骨质疏松症、糖尿病、肥胖等发挥着重要作用。近期的一篇Science文章报道人类癌症66%由环境决定，彻底颠覆了人们的常规认识[13]。复杂疾病的发生受多基因与环境互作网络调控。近年来,大量研究发现,吸烟与肺癌、冠心病、心血管疾病等的发生发展密切相关[14-16]。2017年《Circulation》杂志上的一篇文章发现了位于ADAMTS7基因上游的rs7178051突变与吸烟间的互作关系[15]。研究指出，rs7178051(T)会引起ADAMTS7基因表达下降，从而降低冠心病风险。在rs7178051(T)人群中，不吸烟者比吸烟者患冠心病的风险降低约12%，并且发现香烟提取物会诱导ADAMTS7的表达，从而增加冠心病患病风险。目前尚未有吸烟与骨质疏松症的相关性报道。本研究通过生物信息相关分析，鉴定了骨质疏松症相关基因与吸烟的互作关系。

表3 基因环境互作分析验证互作(吸烟、骨密度)基因(脊椎及髋部骨密度)Tab.3 Validation of smoking-BMD interaction genes by gene-environment interaction analysis (Spine & hip BMD)

图3 基因环境互作分析验证基因相关调控网络Fig.3 Regulatory network for genes verified by gene-environment interaction analysis

为了确保本研究结果的可靠性，我们前期采用严苛的质控标准。针对芯片的多种质量评估结果均很好地符合预期，证明了表达谱芯片质量的可靠性。对于SNP6.0基因型芯片，我们也运用了标准化质控流程。为了剔除相关因素对表型的影响，我们进一步校正了年龄、BMI等协变量的影响，保证了分析结果的可靠性。为了挖掘吸烟与骨质疏松互作基因，本研究采用了双因素方差分析。分析结果显著异于传统差异表达分析，挖掘出大量新的潜在易感基因，表明了该分析方法的创新性和有效性。

本研究提示了多个可能与吸烟及骨质疏松症互作密切相关的核心功能性基因。通路富集分析及蛋白网络互作分析均显示，这些基因间存在显著互作，且EGFR、LRP6、CFTR等同时富集在多个通路中，表明这些基因可能具有广泛的生物学调控功能，从而影响骨质疏松相关代谢过程。

不同细胞间可以通过由缝隙连接蛋白(connexin)组成的离子通道进行物质交换和通讯，该过程被称为Gap junction通路。Gap junction通路具有调节胚胎发育、代谢运输、细胞凋亡、组织稳定等重要功能[17]。已有研究表明Gap junction通路对于成骨细胞分化，维持正常骨发育是必须的。抑制该通路，能促进成骨细胞向脂肪细胞分化，从而可能打破骨平衡[18]。骨骼稳态及成骨细胞分化能力伴随年龄增大而显著下降，研究表明，Gap junction形成能力与年龄呈负相关，这可能部分解释了为什么老年人骨质疏松症频发的现象[19]。Gap junction通路已被证实和癌症相关，早期研究认为该通路发挥肿瘤抑制因子的作用，而近期的研究表明该通路也会促进部分肿瘤恶化[20]。本研究结果显示Gap junction可能与骨质疏松症及吸烟相关。吸烟增加多种癌症风险已被广泛证实，本研究提示Gap juncton通路可能是一个潜在的癌症和骨质疏松症共有分子通路，这对于吸烟人群骨质疏松症患者的药物选择或骨肉瘤的药物靶点设计具有重要的指导意义。

通路富集分析结果显示，CFTR(编码氯离子通道囊性纤维化跨膜传导调节因子)富集在多个骨疾病相关的代谢通路中。另有研究显示，该基因突变会导致囊性纤维化(CF)[21-22]，而CF会影响许多器官(例如肺和胰腺)，通常也会导致骨密度(BMD)降低，增加骨折的风险[23]。一些研究表明，成骨细胞中CFTR活性的丧失降低了骨保护素(OPG)的分泌，导致炎症驱动的骨吸收加重[24]。此外，科学家在呼吸道相关疾病研究中发现，香烟烟雾在体外和体内都会降低CFTR活性[25-26]。由此推知，吸烟通过降低人体内的CFTR活性，从而影响OPG的分泌，导致BMD降低。因此，通过吸烟可能与CFTR基因互作，从而引起骨折及骨质疏松症的发生。然而，这需要进一步的实验验证。已有大量研究表明，Wnt通路对于骨骼发育和维持至关重要。我们的研究提示，LRP6(脂蛋白受体相关蛋白6)及WNT16(人类基因组的19个WNT配体之一)基因可能是2个Wnt通路的核心基因，参与了吸烟介导的骨质疏松症进程。已有多项研究指出，LRP6及WNT16基因均会影响骨质疏松症[27-28]。MANI等[29]发现，LRP6基因突变的个体会引起骨质疏松症等复杂疾病的发生。LRP6 rs1181334多态性与墨西哥绝经后妇女髋部BMD的降低有关[30]。此外，动物实验表明，LRP6控制小鼠的成骨细胞分化[31-32]。同样，全基因组关联分析发现，WNT16基因上的两个错义多态性与80岁以下个体的BMD及髋部骨折相关[33]。表皮生长因子受体(EGFR)是与肺癌密切相关的明星基因，EGFR突变与非小细胞肺癌发生高度相关[34-35]。2015年，FAN等[36]研究表明，EGFR是调节成骨细胞功能的必要分子，上皮调节蛋白(一种新的EGFR配体)能够通过EGFR-AKT-mTOR信号通路调控体外成骨细胞功能。这说明EGFR不但与肺癌的发生相关，还参与调节成骨细胞的功能。JAFARI等[37]研究表明siRNA介导的PRKG1功能(siPRKG1)丧失能够促进人骨髓间充质干细胞(hMSC)向成骨细胞(OB)分化，这说明PRKG1对成骨细胞分化和骨形成发挥抑制作用。他们进一步研究表明，在骨缺损位点植入hMSC中的PRKG1的药理学抑制剂可以增强骨再生[38]。健康成人BMD的表型变化受遗传和环境因素的共同影响。虽然目前缺乏ADCY9基因影响骨质疏松症的相关报道，但有研究证明，ADCY10基因(可溶性腺苷酸环化酶)的序列变异与高钙尿症患者的低脊柱BMD相关，ICHIKAWA等[39]研究发现，在绝经前白人妇女中，ADCY10多态性与脊髓面积BMD之间有相关性。

本研究基于大数据挖掘，从基因环境互作分析的新角度，鉴定出了一个可能与吸烟及骨质疏松症互作相关联的关键分子通路及多个核心功能性基因。研究结果对于骨质疏松症致病机制认识及相关药物靶点设计均具有重要指导意义。

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