黄芪百合颗粒对亚硝酸钠中毒小鼠增强缺氧耐受力的作用及机制

张丽昕，苏 韫，颜春鲁，刘永琦,2，张苡铭，陈 刚，冯彩琴，成新平

(1. 甘肃中医药大学，甘肃省高校重大疾病分子医学与中医药防治研究省级重点实验室，甘肃兰州 730000；2. 敦煌医学与转化省部共建教育部重点实验室，甘肃兰州 730000)

亚硝酸钠(NaNO2)是重要的工业原料，因其与食盐类似而常常被误食，引起中毒；它也是日常生活中常被使用的食品添加剂和动物饲料添加剂[1]，隔夜菜中也含有亚硝酸钠，一般情况下，人体摄入0.3～0.5 g的亚硝酸盐即可引起中毒。亚硝酸钠中毒是因其使生物体内血红蛋白由二价铁转变为三价生成高铁血红蛋白(MetHb)，破坏血红蛋白携氧能力，而造成组织细胞缺氧，且随着亚硝酸钠剂量的增加，MetHb含量增加，将导致组织缺氧直至死亡。三价铁不但不能输送氧，而且还阻碍同一血红蛋白的二价铁释放氧，使氧合血红蛋白解离曲线左移，进一步阻碍氧的输送和利用[2]，因此，亚硝酸盐中毒严重损害心、脑、肺功能。中药复方黄芪百合颗粒由黄芪、百合、红景天等组成，具有益气解毒、养阴润肺、清心安神、增强免疫等功效，在中医辨证论治上与亚硝酸盐中毒是比较对症的,且已有研究证实黄芪百合颗粒具有抗氧化损伤的作用[3]。故本研究通过观察黄芪百合颗粒对亚硝酸钠中毒小鼠存活时间、过氧化氢酶(CAT)活性和三磷酸腺苷(ATP)含量以及病理形态学的影响，进一步探明黄芪百合颗粒对缺氧耐受力的作用。

1 材料与方法

1.1实验动物、药物、主要试剂与仪器SPF级昆明(KM)种雄性小鼠60只，鼠龄(6～8周龄)，体质量(20±2)g，由兰州兽医研究所实验动物中心提供(动物质量合格证号：62000600000206；许可证号：SCXK2015-0001)。

黄芪百合颗粒(由黄芪9 g，红景天3 g，百合9 g，陈皮3 g，枸杞6 g，黄精9 g组成)；红景天枸杞胶囊(青海鑫池源生物科技有限公司，批号：20160407)；亚硝酸钠(天津市北辰方正试剂厂，批号：20160220)；40 g/L多聚甲醛(北京索莱科技有限公司，批号：20161024)。CAT试剂盒(批号：20161103)、ATP含量检测试剂盒(批号：20161031)、蛋白定量测定试剂盒(批号：20161103)均购于南京建成生物工程研究所。

VIS-723N型分光光度计(北京瑞利分析仪器公司)，Thermo Scientific型微量加液枪(上海艾研生物科技有限公司)，XB-70型雪花制冰机(宁波新芝生物科技股份有限公司)、电子天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司)，OLYMPUS BX53型正置光学显微镜。

1.2制备亚硝酸钠中毒模型及实验分组小鼠适应性饲养3 d，常规饮食，自由饮水。采用随机数字表法将小鼠分为空白组、模型组、阳性对照组和黄芪百合颗粒低、中、高剂量组，每组10只。各组小鼠按相应剂量每日灌胃给药1次，连续给药30 d。黄芪百合颗粒提取率为0.585，药物的最终量为：39×0.585=22.815 g，按照人与小鼠的体质量换算法：小鼠的等效剂量=22.815 g/60 kg×9.1≈3.5 g/(kg·d)，并分为低、中、高(1.75、3.5、7 g/kg)剂量，分别为临床患者拟用剂量的0.5、1、2倍，临用前用蒸馏水溶解(甘肃中医药大学科研实验中心中药药理与毒物实验室)；阳性对照组给予红景天枸杞胶囊液，人体每日推荐量为53.33 mg/kg，按照人与小鼠的体质量换算为0.5 g/(kg·d)；空白对照组及模型组给予等体积的生理盐水。

1.3亚硝酸钠中毒缺氧实验末次给药1 h后，除空白对照组外，其余各组小鼠腹腔注射20 mg/mL亚硝酸钠溶液(注射量为0.1 mL)后，放于250 mL广口瓶中，立即用涂有白凡士林(保证其密闭性)的盖子盖紧瓶口，并开始计时，以呼吸停止为指标，记录小鼠的存活时间，并计算存活时间延长率=[(各药物组存活时间-模型组存活时间)/模型组存活时间]×100%。

1.4脏器指数测定在小鼠腹腔注射亚硝酸钠溶液前称体质量，待小鼠呼吸停止后，分离脑组织和心脏，用生理盐水冲洗数遍后用滤纸吸干水分，称重并计算心脑的脏器指数：小鼠心(脑)脏器指数=小鼠心(脑)组织质量(mg)/小鼠体质量(g)。

1.5脑、心、肺组织CAT活性检测称取脑、心、肺组织，用生理盐水在冰水浴条件下制备成10%匀浆，2 500 r/min离心10 min，吸取上清并稀释成最佳取样浓度，测定CAT活性。具体步骤按照试剂盒说明书依次加入试剂后，在波长405 nm、光径0.5 cm处测定各管的吸光度(A)值并计算：组织匀浆中CAT活力(U/mg prot)=(对照A值-测定A值)×271×(1/60×取样量)/待测样本蛋白质量浓度(mg prot/mL)。

1.6磷钼酸比色法检测脑、心、肺组织ATP含量称取脑、心、肺组织，按照试剂盒说明书测定ATP含量并计算：ATP(mmol/mg prot)=(测定A值-对照A值)/(标准A值-空白A值)×标准品浓度(1×103μmol/L)×样本测定前稀释倍数/待测样本蛋白质量浓度(mg prot/mL)。

1.7脑、心、肺组织病理观察及病理评分取脑、心、肺组织经40 g/L多聚甲醛固定1周，HE染色，镜下观察病理形态学变化。各组分别观察每只小鼠的组织HE染色切片，每张切片取5个高倍镜视野并以损伤最严重的视野计分。

肺脏病理评分方法：观察肺毛细血管扩张、出血、肺间质增宽、肺泡扩张程度或断裂。按照肺组织结构损伤程度自轻至重分为5个等级：0分，肺血管、间质、肺泡及支气管正常；1分，间质及肺泡出血范围<25%，肺间质轻度增宽；2分，间质轻度增宽，肺泡腔出血范围25%～50%，肺泡扩张或断裂；3分，间质中度增宽，肺泡腔出血范围50%～75%，肺泡明显扩张或断裂，局部有肺萎缩；4分，间质显著增宽，肺泡腔出血范围>75%，肺泡明显扩张或断裂，肺间质红细胞渗出严重，肺泡壁受压变窄。

心脏病理评分方法：观察心肌细胞、心肌间质血管扩张程度、心内膜细胞水肿变性。按照心脏组织结构损伤程度自轻至重分为5个等级：0分，心肌细胞大小、形态基本正常；1分，心肌间质血管扩张充血较轻，心内膜下细胞水肿轻微变性；2分，心肌细胞减少，心肌间质血管扩张充血轻，心内膜下细胞水肿变性；3分，心肌细胞变小，心肌间质血管扩张充血较重，心内膜下细胞水肿变性较重；4分，心肌细胞形态不正常，心肌间质血管扩张充血严重，心内膜下细胞水肿变性严重。

脑组织病理评分方法：观察神经细胞、脑组织形态、血管及周围神经间隙。按照脑组织结构损伤程度自轻至重分为5个等级：0分，神经元大小、形态、血管及周围神经间隙基本正常；1分，神经元少量坏死，出现核周空泡现象；2分，脑神经细胞坏死，组织疏松，血管及神经细胞周围间隙轻度增宽；3分，神经元大量坏死，组织疏松，血管及神经细胞周围间隙中度增宽；4分，脑神经细胞坏死严重，胞质浓缩，核固缩，且出现核周空泡现象，组织疏松，血管及神经细胞周围间隙显著增宽。

2 结 果

2.1黄芪百合颗粒对小鼠亚硝酸钠中毒存活时间的影响与空白组比较，模型组、阳性对照组、黄芪百合颗粒各剂量组小鼠存活时间明显下降(P<0.01)；与模型组比较，黄芪百合颗粒低、中剂量组存活时间显著延长(P<0.01)，高剂量组小鼠存活时间虽有延长，但差异无统计学意义(表1)。

表1 黄芪百合颗粒对小鼠亚硝酸钠中毒存活时间的影响Tab.1 Effect of Radix Astragali Lilium Granules on the survival time of NaNO2 intoxication mice

2.2黄芪百合颗粒对亚硝酸钠中毒小鼠脑、心脏指数的影响与空白组比较，模型组脑、心脏指数降低(P<0.05)；与模型组比较，阳性对照组、黄芪百合颗粒低、中、高剂量组脑、心脏指数均升高(P<0.05，P<0.01，表2)。

2.3黄芪百合颗粒对肺、心、脑组织CAT活性的影响与空白组比较，模型组小鼠肺、心、脑CAT活性明显减弱(P<0.05，P<0.01)；与模型组对比，阳性对照组、黄芪百合颗粒低、中、高剂量组小鼠肺、心、脑组织CAT活性明显升高(P<0.05，P<0.01，表3)。

2.4黄芪百合颗粒对肺、心、脑组织ATP含量的影响与空白组比较，模型组小鼠肺、心、脑组织ATP含量明显下降(P<0.01)，与模型组比较，黄芪百合颗粒低、中高剂量组肺、心、脑组织ATP含量均升高(P<0.05，P<0.01，表4)。

表2 黄芪百合颗粒对亚硝酸钠中毒小鼠心、脑脏器指数的影响Tab.2 Effect of Astragali Lilium Granules on the organ indexes of heart and brain of NaNO2 poisoned mice

表3 各组小鼠肺、心、脑组织中CAT活性变化Tab.3 Changes of CAT activity in lung, heart and brain tissues of mice U/mg prot)

表4 小鼠肺、心、脑组织ATP含量的变化Tab.4 Changes of ATP content in lung, heart and brain tissues of mice mmol/mg prot)

2.5黄芪百合颗粒对亚硝酸中毒小鼠肺、心、脑组织病理形态改变的影响空白组小鼠窒息而死，可见部分肺泡扩张，但大部分组织正常，肺泡间质无充血水肿，肺泡大小、形态基本正常，无明显病理改变。与空白组相比，模型组肺泡组织扩张、融合，间质内红细胞渗出，肺泡间隔增厚或断裂，肺泡壁狭窄；与模型组相比，阳性对照组出现肺泡组织扩张、融合减轻，间质内红细胞渗出减轻，有肺泡扩张或断裂，毛细血管扩张、出血；黄芪百合颗粒低剂量组肺泡组织扩张、融合减轻，间质内红细胞渗出有所减轻，壁增厚、肺泡断裂或扩张、毛细血管扩张出血减轻，肺泡壁狭窄逐渐变缓；中剂量肺泡肺泡组织扩张、融合明显减轻，肺泡断裂或扩张、毛细血管扩张出血较轻，改善较为明显；高剂量肺泡肺泡组织扩张、融合明显减轻，间质内红细胞渗出明显减轻，肺泡扩张或断裂，毛细血管扩张、出血改善明显肺泡壁狭窄变缓(图1)。

空白组心肌细胞大小、形态基本正常，无明显病理改变。与空白组比较，模型组心肌间质血管扩张充血严重，心外膜下局部细胞水肿变性明显。与模型组比较，阳性对照组小鼠心间质充血较严重，心外膜下水肿变形较严重；黄芪百合颗粒低剂量组小鼠心间质充血明显减轻，心外膜下水肿变形变轻；中剂量组小鼠心间质充血较轻，心外膜下水肿较轻；高剂量组小鼠心肌间质血管扩张充血不明显，心外膜下水肿较轻(图2)。

空白组神经元大小、形态基本正常，无明显病理改变;与空白比较，模型组出现脑神经细胞坏死，胞质浓缩，核固缩，且出现核周空泡现象，组织疏松，血管及神经细胞周围间隙增宽；与模型组比较，阳性对照组脑神经细胞坏死减轻，组织疏松，血管及神经细胞周围间隙增宽；黄芪百合颗粒低剂量组见脑神经细胞少量坏死，出现核周空泡现象；中剂量组脑神经细胞坏死程度有所减轻，核周空泡减少；而高剂量组小鼠脑神经细胞坏死程度明显减轻，核周空泡减少(图3)。

图1 各组小鼠肺组织的病理变化(A-F)，HE×200及病理评分比较(G)Fig.1 Pathological changes (A-F) and pathological scores (G) of lung tissue

图2 各组小鼠心组织的病理变化(A-F)，HE×200及病理评分比较(G)Fig.2 Pathological changes (A-F) and pathological scores (G) of heart tissue

图3 脑组织的病理变化(A-F)，HE×200及病理评分比较(G)Fig.3 Pathological changes (A-F) and pathological scores (G) of brain tissue

3 讨 论

亚硝酸钠是一种剧毒的化学药品，与血红蛋白的结合能力很强，结合后使血红蛋白中的二价铁变成三价铁从而形成MetHb或变性血红蛋白，同时与羟基牢固结合而丧失携氧能力,使剩余二价铁离子与氧的亲和力增高，导致氧离曲线左移，造成组织缺氧[4]。组织缺氧时，能量供应不足，ATP生成受阻，代偿性ADP分解加强，ADP分解成腺苷、次黄嘌呤、黄嘌呤等，后二者在黄嘌呤氧化酶作用下，在形成尿酸的过程中，产生超氧阴离子(O2)自由基，自由基大量生成,使防御系统CAT酶活力下降，不足以清除过量的自由基，从而引起脂质过氧化瀑布状的连锁反应和微循环障碍，导致组织中大量细胞受损[5]。并且CAT是体内抗氧化系统的主要成分，能阻止H2O2转变为·OH，使之分解为H2O和O2。本实验模型组小鼠注射了亚硝酸钠后，表现出明显的缺氧症状，呼吸短促，皮肤黏膜呈深咖啡色，ATP、CAT含量明显下降，肺组织广泛水肿，红细胞渗出，肺泡间隔增厚或断裂，肺泡壁狭窄，出现明显肺气肿，局部有肺萎缩；心肌间质血管扩张充血严重，心外膜下局部细胞水肿变性；对脑部造成急性损伤[6]，促使脑神经细胞坏死，胞质浓缩，核固缩，且出现核周空泡现象，组织疏松，血管及神经细胞周围间隙增宽等一系列明显的缺氧表现。

为了缓解亚硝酸钠中毒所导致的缺氧和细胞损伤，本实验采用了中药复方制剂黄芪百合颗粒为实验药物(由黄芪9 g，红景天3 g，百合9 g，陈皮3 g，枸杞6 g，黄精9 g组成)，黄芪是传统补气的中药，具有补气固表、益气脱毒、敛疮生肌、补中益气的功效。现代药理学研究发现，黄芪含有黄芪多糖、黄芪黄酮、黄芪皂苷等多种活性物质，具有清除自由基、减少脂质过氧化、抑制血小板聚集[7]、减轻脑水肿、延长缺氧小鼠存活时间等作用[8]。百合甘、微寒，具有养阴润肺、清心安神、增强免疫等功效[9]。现代药理研究表明，百合皂苷具有清除自由基的作用[10]，百合多糖具有抗氧化、抗纤维化等多方面的药理作用[11]。红景天主要生长在北极圈和高寒的山区，是一种传统的药用植物，经研究发现其具有多方面的效能，如缓解体力疲劳、增强耐力、抗氧化、抗衰老、抗病毒、抗肿瘤、抗炎和保护神经系统等作用[12-13]，具有改善机体耐缺氧的能力[14]。陈皮味苦辛平无毒，理气健脾、燥湿化痰等功效[15]。研究表明，陈皮黄酮类成分具有抗炎、抗氧化、抗癌、降血脂等药理活性[16-18]，挥发油类成分主要有抗菌、抗炎等药理作用[19-20]。上述诸药都具有抗氧化损伤的作用。实验中给予低剂量的黄芪百合颗粒后，可见肺泡组织扩张、融合减轻，肺间质内红细胞渗出减轻，肺泡壁狭窄减缓、肺泡断裂或扩张、毛细血管扩张出血减轻；小鼠心间质充血明显减轻，心外膜下水肿变形变轻；脑神经细胞少量坏死，出现核周空泡；给予中剂量的黄芪百合颗粒后肺泡断裂或扩张、毛细血管扩张出血较轻，改善较为明显；小鼠心间质充血较轻，心外膜下水肿较轻；脑神经细胞坏死程度有所减轻，核周空泡减少；给予高剂量的黄芪百合颗粒后肺泡组织扩张、融合明显减轻，肺间质内红细胞渗出减轻，肺泡壁狭窄减缓肺泡扩张或断裂，毛细血管扩张减轻；小鼠心肌间质血管扩张充血不明显，心外膜下水肿较轻；小鼠脑神经细胞坏死程度明显减轻，核周空泡减少。

本实验结果显示，不论是低、中剂量还是高剂量的黄芪百合颗粒，均延长了亚硝酸钠中毒后小鼠的存活时间；黄芪百合颗粒各剂量组CAT 活性及ATP含量均有提高，对肺、心、脑组织缺氧现象均有不同程度减轻，表明黄芪百合颗粒能够增加组织抗缺氧能力，不同程度地提高心、肺、脑组织对缺氧的耐受力，具有耐缺氧的作用。但其耐缺氧机制是否与红景天相似，即通过减少超氧自由基的积累并增强机体自由基清除能力而发挥作用，尚需要进一步验证。

综上所述，在耐缺氧领域作为单味药红景天的替代品，黄芪百合颗粒可能具有一定的的研发价值和良好的应用前景。

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