检测高效氯氟氰菊酯残留试剂盒的研制

◎ 罗维超，扶 胜，邓小霞，袁学伟

（贵州勤邦食品安全科学技术有限公司，贵州 贵阳 550009）

高效氯氟氰菊酯又叫三氟氯氰菊酯、功夫菊酯等，是一种广谱菊酯类杀虫剂，用于花生、大豆、果树、蔬菜的害虫防治，具有杀虫谱广、活性高、药效迅速、喷洒后耐冲刷等特点。喷洒于蔬菜水果上的农药有一部分会残留，甚至被吸收，人类食用这些蔬菜水果就会使农药中的高效氯氟氰菊酯进入人体，对人体产生危害。国家标准规定，高效氯氟氰菊酯在苹果、李、柑橘等水果以及蔬菜中的最大残留量为0.2 mg/kg[1-2]。为了了解高效氯氟氰菊酯在日常摄入的蔬菜、水果等食物中的残留情况，以保障人民的身体健康以及实现现场大批量短时间的高效氯氟氰菊酯在农产品中的残留检测，本文报道了一种检测方法同时研发出相应的产品，为相关部门进行有关农产品的快速检测工作提供一种可靠的方法。

目前，高效氯氟氰菊酯残留分析一般使用气相色谱法（GC）[3]，还有一些关于高效液相色谱法（HPLC）[4]和色谱质谱联用，这些方法灵敏度较高、测定较为准确，而且可以同时检测多种药物，但其检测成本较高，而且对操作人员有较高的要求，因此限制了此种检测方法在样品进行现场、批量、快速检测的使用，从而阻碍了其推广大范围的使用。相比于仪器检测的方法，酶联免疫法操作简便、用时较短，检测成本低、操作人员只需稍微培训即可上手操作，可实现批量样品的快速筛选检测，以及技术的推广使用。目前，在酶联免疫分析领域具有相关的报道，只有王鸣华等进行了人工抗原的合成。目前，尚未有该方法在水果、谷物对于高效氯氟氰菊酯残留检测中应用的报道以及相关检测产品的生产。本文旨在建立一种用酶联免疫吸附分析方法快速、灵敏地检测水果、蔬菜、谷物中高效氯氟氰菊酯，为我国农药残留的现场监控提供理论依据和一种可靠地途径。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小鼠（6～8周龄），贵州勤邦食品安全科学技术有限公司；高效氯氟氰菊酯（纯度≥99%），常熟恒荣商贸有限公司；牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA），上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

匀浆机（常州市万合仪器制造有限公司），电子天平（上海科晓科学仪器有限公司），KS-Ⅱ振荡器（上海圣科仪器设备有限公司），QL-901漩涡混合器（常州亿能实验仪器厂），低速离心机、氮吹仪（贵州勤邦食品安全科学技术有限公司），微量移液器（单道20 ～ 200 μL、100～ 1 000 μL，多道 20 ～ 300 μL，浙江力辰仪器科技有限公司），生化培养箱（上海平轩科学仪器有限公司），酶标仪（北京线上生物科技有限公司），旋转蒸发仪、低温冷却水循环泵（巩义市予华仪器有限责任公司），三用紫外分析仪（成都启运通仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 高效氯氟氰菊酯半抗原的合成

（1）高效氯氟氰菊酯原药的氧化。高效氯氟氰菊酯双键氧化反应如图1所示。在三口瓶中，将高效氯氟氰菊酯溶于乙腈，并冷却到0 ℃，开始分批加入高锰酸钾，每批间隔3 min，加毕，保持温度搅拌反应，当高锰酸钾的紫色刚好褪去时，快速过滤，用10 mL丙酮洗涤滤饼，合并洗涤液和滤液，进行减压蒸馏，得黄色油状液体，将该油状液体进行硅胶柱层析，干法装柱，收集Rf值最小的那个点的组分，得到淡黄色油状液体，即为目标产物。

图1 高效氯氟氰菊酯双键氧化反应图

（2）半抗原的制备。将第一步的产品溶于重蒸处理过的二氯亚砜中，加入1滴DMF，氮气保护下室温反应过夜，次日，将反应液进行减压蒸馏，蒸干后向剩余物中加入10 mL正己烷，蒸干，再加入，再蒸干，如此循环3次后得黄色油状液体。将此油状液体快速称重确定质量，然后立即溶于干燥的四氢呋喃中，-20 ℃保存备用，将4-氨基丁酸溶于氢氧化钠水溶液中，氢氧化钠为1当量，冰浴冷却到0 ℃，然后缓慢滴加冷藏于-20 ℃中酰氯的四氢呋喃溶液，滴毕，保持温度继续反应30 min，然后撤去冰浴恢复室温反应2 h，TLC法确定反应完全后，停止反应，反应液分层，吸出上层溶液，将下层溶液用乙酸乙酯提取3次，每次用量10 mL，合并提取液和上层溶液，用无水硫酸钠干燥，减压蒸馏，得黄色油状液体，将产品用硅胶柱层析提纯，收集Rf值最低的紫外点所示组分，得淡黄色油状液体即为目标化合物。

图2 氧化产物羧基制备酰氯接4-氨基丁酸图

1.3.2 人工抗原的制备

免疫原的制备：称取40 mg半抗原溶于1 mL DMF，加入60 mg EDC和40 mg NHS，室温反应1 h；反应液澄清后，将其缓慢滴加到浓度为30 mg/mL BSA的PBS（pH7.2）中，滴毕，保持室温搅拌过夜；用0.01 mol/L PBS透析3d，每天换2次透析液，透析完成后，以8 000 r/min离心30 min，取上清液，即为相应的免疫抗原，分装，于-20 ℃条件下冻存备用。包被抗原的制备只将牛血清白蛋白BSA更换为卵清蛋白OVA进行和上述方法相同操作即得。

1.3.3 单克隆抗体的制备

用常规的方法制备抗体，用饱和硫酸铵来纯化抗体。

1.3.4 抗原抗体最适工作浓度的选择

分别将包被抗原和单克隆抗体溶液进行稀释，进行间接竞争ELISA的方阵实验，选取OD450最接近于1的抗体浓度作为抗体的最适工作浓度。

1.3.5 间接竞争酶联免疫方法的建立

（1）酶标板的包被。用相应的缓冲液将包被原稀释成最佳工作浓度后，点于96孔酶标板上，每孔100 μL，37 ℃避光保存2 h；弃去包被液，用洗涤液洗涤1次，拍干后每孔200 μL加入封闭液，37 ℃避光保存2h；弃去封闭液后直接拍干即完成板的包被。

（2）标准曲线的测定。加入浓度呈梯度的高效氯氟氰菊酯标准溶液和已经稀释成最佳工作浓度的抗体溶液，每孔50 μL，盖上盖板膜，在25 ℃避光反应30 min后；用洗涤液洗涤四五次，拍干，加入相应的酶标二抗，每孔100 μL，盖上盖板膜，25 ℃避光反应30 min后；洗涤四五次，依次加入显色底物液A液（过氧化脲）、显色底物B液（四甲基联苯胺），每孔加 50 μL，25 ℃显色 15 min，每孔加入 100 μL 2 mol/L H2SO4终止液，设定酶标仪于450 nm处测定每孔吸光度值（OD值）。记录数据，用RIDASCREEN软件进行分析。

1.3.6 标准曲线的绘制

采用间接竞争ELISA方法建立标准曲线，分别选择标准品浓度0、5、15、45、135 ng/mL和405 ng/mL 6个梯度，以浓度为0 ng/L时的OD值为B0值，相应浓度的高效氯氟氰菊酯标准品的OD值为B值，以百分吸光度值（B/B0）为纵坐标，标准品浓度的对数值为横坐标，绘制标准曲线。

1.3.7 样本前处理方法的建立

（1）苹果前处理方法。用均质器均质样本，称取（1.0±0.05）g均质后的苹果样本到10 mL聚苯乙烯离心管中，分别加入5 mL提取剂，用涡旋仪涡动5 min；室温（20～25 ℃）4 000 r/min离心5 min；取上清液50 μL，加入到950 μL复溶液中，充分混匀，分析时每孔取50 μL点于酶标板中。

（2）大豆前处理方法。称取（1.0±0.05）g经匀浆机均质后的大豆样本到10 mL聚苯乙烯离心管中，分别加入5 mL提取剂，用涡旋仪涡动5 min；室温（20～25 ℃）4 000 r/min离心5 min；取上清液50 μL，加入到950 μL复溶工作液中，充分混匀，分析时每孔取50 μL点于酶标板中。

（3）莲花白前处理方法。用均质器均质样本，称取（1.0±0.05）g均质后的蔬菜样本到10 mL聚苯乙烯离心管中，分别加入5 mL提取剂，用涡旋仪涡动5 min；室温（20～25 ℃）4 000 r/min离心5 min；取上清液50μL，加入到950 μL复溶液中，充分混匀，分析时每孔取50 μL点于酶标板中。

1.3.8 试剂盒各项技术参数的确立

（1）样本检测限试验。一定条件下，试剂盒方法检测限（MDL）可用正态分布规律来表，因此可用20个空白样本通过试剂盒测定的光密度在标准曲线上对应的高效氯氟氰菊酯浓度的平均值（）和标准差（S）来表示，MDL=+3S。

（2）准确度和精密度试验。以3个不同浓度的高效氯氟氰菊酯标准品分别对空白苹果、大豆、莲花白样本进行添加回收试验，计算回收率和变异系数。

式中，Cx为添加了一定高效氯氟氰菊酯含量的样本经过标准曲线分析得到的实际浓度，μg/kg；C0为添加空白样本经过标准曲线分析得到的实际浓度，μg/kg；C为添加实际添加的高效氯氟氰菊酯浓度，μg/kg。

（3）稳定性试验。将一定量的试剂盒分为数批保存于4 ℃环境中，每隔1个月取出一批，分别测定其相应零标准品的OD值、IC50，同时做添加回收实验测得回收率，依试验结果对试剂盒的稳定性进行判定；同时将试剂盒进行加速老化试验，每隔1 d取出进行测定，直到试剂盒的灵敏度和回收率开始下降为止。通常在37 ℃进行的加速老化实验显示每稳定1 d，可相当于4～10 ℃保存45 d，以此来确定试剂盒异常条件所能保存的时间。

（4）可靠性试验。随机抽取苹果、大豆、莲花白各20份，用本试剂盒方法与国家标准中的气相色谱法分别对其进行测定，根据对比结果验证试剂盒检测实际样本的准确度。

2 结果与分析

2.1 最佳工作浓度的选择

不同包被原和单克隆抗体的间接竞争抑制ELISA方阵法测定结果（OD450值）见表1。在包被过程中，包被效果与浓度成正比，但如果浓度过高，待测物的竞争能力将会减弱，灵敏度也会受到影响，同时会造成抗原的浪费，而酶标仪测定OD450值的敏感范围在1.00左右，综上所述，根据表中结果，试验的最佳选择为包被原稀释倍数为4.5×104，最佳抗体稀释倍数为1∶25 000。

表1 不同包被原和单克隆抗体稀释浓度的OD450值表

2.2 标准曲线的建立

根据建议的间接竞争ELISA方法，选择高效氯氟 氰菊 酯 标 准 品 浓 度0、5、15、45、135 ng/mL和405 ng/mL，以百分吸光度值（B/B0）为纵坐标（Y），标准品浓度的对数值为横坐标（X）绘制标准曲线，如图3所示。其中相关系数R2=0.9984，IC50为28.8 μg/L。

图3 高效氯氟氰菊酯的标准曲线图

2.3 试剂盒各项技术参数的确定

2.3.1 样本检测限试验由表2可知，根据MDL=+3S，得到试剂盒方法对苹果、玉米、白菜样本的检测限分别为9.25、13.94、43.37 μg/kg。

表2 高效氯氟氰菊酯试剂盒方法检测限表

2.3.2 准确度和精密度试验

ELISA测定的准确度以回收率表示，精密度以变异系数表示。取空白苹果、大豆、莲花白样本，按表2所述的高效氯氟氰菊酯添加浓度对其进行添加回收试验，每个浓度做5个平行，用3个批次的试剂盒测定，各计算出回收率和批内、批间变异系数，见表3。

表3 高效氯氟氰菊酯试剂盒的准确度和精密度表

由表3可知，以3个不同浓度的高效氯氟氰菊酯标准品对空白苹果、大豆、莲花白样本进行添加，其加标回收率范围为68.8%～105.3%，说明试剂盒准确度较好；批内变异系数范围为7.1%～13.2%，批间变异系数范围为7.9%～13.1%，均小于15%，说明试剂盒精密度以及重复性较好。

2.3.3 稳定性试验

将试剂盒分别放置于4 ℃和37 ℃，每隔一定时间取出，根据试剂盒的灵敏度和回收率等参数，判断其稳定性。经测定，该试剂盒能在37℃条件下稳定保存9 d，第10 d开始各项参数开始下降，而在4 ℃条件下至少保存15个月仍可保持灵敏度和回收率等参数。

2.3.4 可靠性试验

通过试剂盒方法和仪器方法对随机抽取的苹果、大豆、莲花白样本进行测定，苹果、大豆、莲花白样本的阳性判定限分别为20、30、60 μg/kg，结果筛选出1份阳性苹果样本和3份阳性莲花白样本，比较结果见表4。

表4 ELISA法和GC法检测结果比较表（单位：μg/kg）

由表4可知，对高效氯氟氰菊酯残留的测定用ELISA法和GC法的测定结果基本一致，符合度达到99%以上。

3 结论

高效氯氟氰菊酯很耐雨水冲刷，从而易残留在农产品中，甚至被农产品吸收。人们摄取这些残留了高效氯氟氰菊酯的蔬菜以后，极易在人体中大量富集，影响人们的身体健康，而目前，高效氯氟氰菊酯在水稻、蔬菜、果树等农作物中还在广泛使用，非常有必要对其含量进行监控，保障人民的身体健康，这就决定了在人们经常获取农产品的菜场、超市等场所必须有一定力度的农药残留抽检工作，若用仪器方法进行抽检，虽然检测的灵敏度和准确度都非常高，可是单个样品的检测所用时间较长，而且需要专门的人负责检测工作，这就造成了检测效率低下的后果，非常不利于广泛的推广使用，而ELISA试剂盒则不需要专业的人员进行操作，稍微进行培训就可以进行检测工作，甚至可用于商家自身对产品的检测，由于其单个样品检测所用的时间较短，所以通常用于大批量的样品进行抽检，检测的灵敏度和仪器方法几乎一致，是一种值得信赖的检测方法。

[1]颜丽菊，何计龙，朱潇婷，等.高效氯氟氰菊酯在杨梅果实中的残留研究[J].中国果树，2017（1）：43-45.

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[3]刘博静，赵春苗.气相色谱法快速测定菠菜中高效氯氟氰菊酯残留量[J].沧州师范学院学报，2018（1）：21-24.

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