基因组重排技术在微生物菌种改良中的应用

申屠旭萍,姚佳忆,俞晓平

(中国计量大学 生命科学学院,浙江省生物计量及检验检疫技术重点实验室,浙江 杭州 310018)

基因组重排技术这一概念的首次提出是在2002年Nature上发表的一篇文章,这篇文章的作者Zhang等一直致力于通过DNA重组和定向进化来改良菌株[1].DNA重组是一种通过随机片段和聚合酶链式反应在体外对选定的突变基因进行体外同源重组的方法[2-4].通过DNA重组,成功地完成了多个基因和通路的分子定向进化[5-8].基因组重排技术是在DNA重组基础上结合传统育种技术,通过多亲本之间的DNA重组和全基因组片段交换,将多个优良表型重组在一起的过程[1].它被认为是对菌株表型改良的组合方法的应用,并被誉为菌株选育和代谢工程的一个重要里程碑[9].

1　基因组重排的概述

微生物的育种方式多种多样,从传统菌株育种技术到分子改造技术,现在人们可以更加理性地对微生物进行改造从而获得目的菌株[10-12].野生型菌株的产物产量往往较低,因此需要通过人工或者实验室手段对其进行改造.基于序列随机突变和筛选的传统菌株育种技术是提高工业微生物产量的主要方法,因为这种方法无需了解菌株的遗传信息,也无需进行遗传操作[13].人们通过连续的诱变和筛选获得目的菌株,然而这个过程十分漫长,而且突变频率低,耗时耗力,1年可能仅仅只提高菌株10%的代谢产物产量[14],更有可能会造成菌株的回复突变.由于对大部分菌株的遗传信息缺乏了解,使得传统的育种技术存在很大的局限性.

相较于传统菌株育种技术,基因组重排具有非常明显的优势.基因组重排技术突破了传统菌株育种技术的局限性,它是一种基于原生质体递归融合的新型分子育种技术,是分子定向进化在全基因组水平上的延伸[1,9].相较于传统菌株育种技术,基因组重排更为省时省力,两轮重排就能达到20年的经典育种效果[1].而且大部分的育种技术为了获得目的表型,通常基因突变来源较为单一，而基因组重排技术则由于多亲本之间的递归融合,有较多的基因来源,能使许多正向突变的表型聚集在一起.

2　基因组重排的过程

基因组重排的过程分为:1)亲本菌株的选择;2)亲本菌株原生质体制备与融合;3)融合子的筛选(图1).因此,它的成功取决于亲本菌株的选择,及原生质体融合重组的效率以及筛选的方法.

图1　基因组重排的过程Figure 1　Process of genome shuffling

2.1　亲本菌株的选择

基因组重排的第一步就是获取一个基因多样化的亲本库.随着进化工程的发展,菌株的多样性分布也随之发生变化.重组使基因产生了新的排列,从而增加了菌种的遗传多样性.

我们所需的表型有时能在自然界中找到,但不一定存在于目的菌株.这些理想表型可能存在于目的菌株的同源菌株或者突变株中,而这些菌株就可以作为具有优良表型的亲本菌株,进行基因组重排.突变存在于整个基因组[14-15],不同的突变方式会产生不同的突变体,导致每个突变体具有特异性,从而增加了突变体的多样性[16-17],因此这些不同类型的突变体可以作为具有优良表型的亲本菌株.在基因组重排实验中,化学或物理诱变常被用于诱导产生不同类型的突变株,从而使亲本菌株具有遗传多样性.

Li等用五株链霉菌包括稠李链霉菌(Streptomycespadanus)、灰褐链霉菌(Streptomycesgriseofuscus)、禾粟链霉菌(Streptomycesgraminearus)、吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)和小白链霉菌(Streptomycesalbulus)分别用紫外诱变和亚硝基胍(NTG)诱变作为多样性来源,得到最佳突变株后进行重组,以期进一步提高聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine)的产量[18].

最近,通过核糖体工程选育获得的自发突变菌株增加了菌株的遗传多样性,同时也为基因组重排提供了优良的亲本.Wang等在对活跃链霉菌(Streptomycesactuosus)亲本菌株改良时,发现核糖体蛋白S12发生了突变,且突变位点存在多样性.其中大多数有效突变发生在K88R,而在S12蛋白的N端还存在其它的突变,主要检测到的有Q6N(C,L)、Q5I(L,P)和I4T(F)等突变[19].因此,核糖体工程可以作为基因组重排中亲本菌株获得的有效方法.

2.2　原生质体融合

实现菌株基因重组最常见的方法就是原生质体融合.对于基因组重排来说,可以通过多种菌株的原生质体融合获得新的重组子.原生质体融合的具体过程包括利用酶将菌株细胞壁去除获得原生质体,然后利用电融合或者聚乙二醇(polyethylene glycol,简称PEG)等方法进行融合,随后进行复壁,并对获得的融合菌株进行筛选.原生质体最重要的一个优点在于它能将不同类型的菌株融合到一起,理论上讲,任何原生质体都可以融合到一个融合子中[20].尽管融合的效率很低,但实践证明,一轮的原生质体融合可成功地将拥有四个不同营养缺陷型标记的天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)融合到一株菌株中.这意味着多个突变体之间的重组可以同时发生,从而通过产生更多的组合和排列来加速进化过程.经过四轮递归融合后,统计每轮增加的重组比例,结果表明携带两个标记的菌株从第一轮的8.4%提高到第四轮60%,而携带三个和四个标记的菌株分别从0.73%增加到17%和从0.000 05%到2.5%[1].

Hopwood提出了利用紫外线辐射等方法将原生质体灭活后进行融合,能有效提高原生质体的融合效率[20].因为失去了细胞壁的原生质体,在灭活过程中染色体更容易被损伤.理论上,对于同种亲本菌株的原生质体使用相同的方法灭活,易导致亲本菌株因染色体损伤部位相同无法互补而难再生.但利用不同方法灭活,就可以使亲本菌株因染色体不同部位的损伤可以得到互补,从而能有效获得融合菌株[21].

2.3　融合子的筛选

将递归原生质体融合后得到的融合子进行筛选获得所需表型,是确保整个基因组重排过程成功的关键一步.尽管获得遗传多样性的方法有很多,但筛选的方法仍有待开发.

通过选择培养基或者改变培养条件可以筛选出耐受性改良菌株,但长期以来,代谢产物的高产一直被认为是一种难以获得的表型.利用经典的生理生化性状的方法可以获得部分高产菌株,如利用菌株的代谢产物在培养基上产生的水解区、透明区、抑菌区等对高产菌株进行筛选.例如,利用clear zone方法来筛选能够直接分解淀粉生产L-乳酸的高产菌株[22].该菌株首先在含CaCO3的培养基上进行筛选,能产生乳酸的菌株可在培养基上产生清晰的区域.然后对筛选得到的菌株进行淀粉酶的测试,可以在CaCO3和淀粉-碘板中产生清晰区域的菌株被确定为理想的菌株.然而大部分活性次生代谢产物产量的提高不能通过表型的方法来筛选.

Dai等利用营养缺陷性菌株对革兰氏阴性菌大肠杆菌(Escherichiacoli)进行基因组重排[23].但是,营养缺陷的遗传标记会影响到菌株的生理和代谢,产生“先天不足”的后代,从而降低了生理性能.因此,在基因组重排的过程中,应进一步发展高效的筛选方法.Zhang等利用灭活亲本原生质体的方法对树状多节孢(Nodulisporiumsylviform)进行融合重组,发现多亲本原生质体的失活可以避免遗传标记的众多过程,从而提高了重组的筛选效率[20].

最近,一些较为新颖的筛选方案应用于获得所需的菌株.例如,在培养基中添加菌株产物类似物,能有效分离得到高产菌株.Hid等利用一种类似于羟基柠檬酸(HCA)的抗生素反式环氧丙烯酸(EAA),筛选HCA高产菌株[24].EAA抑制了非融合原生质体的再生,从而筛选获得融合后的重组菌株.有人将核糖体工程和基因组重排结合在一起,利用菌株的抗药性来获得高产菌株.Zheng等利用博来霉素作为抗性标记,对酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)进行基因组重排,筛选得到目的菌株,其生产乙醇的能力和对乙酸的耐受性都有显著的提高[25].Wang将基因组重排和核糖体工程结合起来,对活跃链霉菌(S.actuosus)进行改造,重组菌株对链霉素的抗性从20 μg/mL到500 μg/mL,其产物诺西肽(Nosiheptide)产量提高了9.2倍[19].

3　基因组重排的应用

基因组重排近几年被证明是一种有效进化细胞工程的方法,用来快速改良微生物表型.基因组重排不仅可以提高菌株代谢产物产率,还可以提供菌株复杂的代谢和调节网络的信息和数据的来源[26].

3.1　提高菌株代谢产物产量

微生物是许多生物制品的来源,包括抗生素、抗肿瘤化合物、免疫抑制剂、抗病毒、抗虫药等.大多数微生物都具有复杂的表型,它依赖于遗传水平上的多重调控,许多都需要涉及多个基因的操作,特别是在次生代谢产物的合成中.基因组重排技术被证明是能融合复杂表型的方法.

近几年,基因组重排技术成功改良微生物,使菌株产活性物质的能力快速提高.由刺糖多孢菌(Saccharopolysporapinosa)产生的多杀菌素是一种非常有前景的抗虫药物,广泛地使用在谷物储存,以及蔬菜、水果、观赏植物等的病虫害防治上,且具有低毒、低残留、对昆虫天敌安全、自然分解快的优点[27].然而,多杀菌素的开发受到了刺糖多孢菌产素水平低的严重限制.Wang等利用基因组重排技术,提高多杀菌素的产量.与原始菌株相比,融合子多杀菌素的产量增加了约3.7倍[28].

达托霉素是玫瑰孢链霉菌(Streptomycesroseosporus)生产的一种抗生素,一般用于治疗由革兰氏病原体引起的皮肤和皮肤结构感染[29].Yu等人利用基因组重排技术,经过四轮融合,成功地将达托霉素的产量提高了4.8倍[30].

3,7,15-Trihydroxy-5-androsten-17-one(7,15-diOH-DHEA)是新型口服避孕药优思明(Yasmin)的关键中间体,通过亚麻刺盘孢菌(Colletotrichumlini)催化脱氢表雄酮(DHEA)获得.Sun等人通过3轮基因组重排,使C.lini催化DHEA获得7,15-diOH-DHEA能力提高了97.8%[31].

3.2　提高菌株对环境的耐受性

环境耐受性是一种较为复杂的表型,这些特性包括菌株对产品、基质、副产品以及温度、pH等环境因素的耐受性.大部分菌株的耐受性是受基因调控,并与其它基因相互作用.因此,对这些耐受表型进行合理的代谢工程改造成为一项艰巨的任务.而基因组重排在改良菌株耐受性方面较有优势.

乳酸在食品和制药工业中应用广泛,因此乳酸产生菌发酵水平越高越好,目的产物浓度高,下游工序成本就降低.然而,乳酸的产生会受到底物葡萄糖的抑制,因此有必要在乳酸发酵过程中提高糖耐受度.Yu等应用基因组重排提高鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)对葡萄糖的耐受性,同时提高了乳酸的产量.第二轮基因组重排之后筛选获得的菌株其乳酸产量、细胞生长和葡萄糖消耗分别高于野生型71.4%、44.9%和62.2%[32].

醇类物质作为新型能源广泛应用于工业生产中.然而异丙醇、丁醇和乙醇(IBE)对于IBE生产菌拜式梭菌(ClostridiumbeijerinckiiDSM 6423)的生长具有很强的抑制作用.Gérando对拜式梭菌进行NTG化学诱变获得亲本菌株后进行多轮基因组重排,得到了一株能承受高达50 g/L异丙醇的重组菌株,较原始菌株提高了49%[33].

木质纤维素水解与乙醇同步发酵能获得新型燃料纤维乙醇,然而在木质素水解过程中,许多副产物如羟甲基糠醛等对发酵菌株酿酒酵母(S.cerevisiae)的生长和代谢具有抑制作用.Cheng等利用4轮基因组重排,使酿酒酵母对木质素水解副产物5-羟甲基糠醛(5-(hydroxymethyl)-furfural, HMF)的耐受性提高了1倍,大大的提高了菌株的发酵水平[34].

3.3　合成新化合物

重组子为亲本基因组随机重组的嵌合体,两类原本不在同一个生命体中同时出现的基因,经过随机重组结合到一起,在某种环境下由于某种特殊的机制产生某种未知的新物质[35].

Wang等从红豆杉中分离得到一株产紫杉醇的内生真菌Tuberculariasp. TF5,然而在实验室长期培养过程中逐渐失去了合成紫杉醇的能力,尝试通过基因组重排使菌株重新具有合成紫杉醇的能力.可是经过基因组重排后,并未获得紫杉醇,而是获得了5种新的倍半萜类化合物,2种新的二氢异香豆素(dihydroisocoumarins)和1种新的四氢萘酮(tetralone)[36].

3.4　提高底物的利用率

菌株有效利用底物的能力也是一种理想的表型.通过基因组重排的方法,也可以获得改良底物利用能力的菌株.

五氯酚(PCP)是一种剧毒的农药,解氯芬鞘氨醇杆菌(Sphingobiumchlorophenolicum)能降解PCP.然而,解氯芬鞘氨醇杆菌并不耐受高浓度的PCP. Dai等利用基因组重排提高解氯芬鞘氨醇杆菌对PCP的分解能力[34].对获得的融合菌株分析表明,该菌株的生长速率大大加快,同时和降解PCP相关的基因的表达水平显著提高,对PCP及其代谢物毒性的耐受性也明显增强[37].

多环芳香烃(PAHs)是假单胞菌(Pseudomonassp. DHT)的底物,但是PAH的降解速度很慢.Kumar等人采用基因组重排技术,提高菌株DHT对PAHs的降解能力.基因重排后获得的菌株在液体培养基中降解多环芳烃的能力显著提高[38].

3.5　增加遗传多样性

除了改良工业菌株,基因组重排方法还可以增加我们对代谢网络及其调控的认识.基因组重排的过程中,可以完成多种初始菌株的遗传性状重组,从而增加了菌株的遗传多样性.基因组重排实验中菌株进化产生的表型很可能改变了代谢网络调节或者运输机制.最近,Lv等用扩增片段长度多态性分析了基因组重排得到的绿产色链霉菌(Streptomycesviridochromogenes),发现其种群的遗传特征发生了变化,其独特的多态性条带可能与卑霉素的产量增加有关[39].聚类分析进一步表明,与卑霉素生产能力相似的重组体具有类似的基因组变异.因此,通过对菌株表型工程的分析可以获得代谢变化相关的遗传变异信息.

Wang等利用基因组重排改良了小白链霉菌(S.albulus),对其进行AFLP分析,结果表明在初始菌株W-156、突变体A-79和重组体AG1-188和AG 3-28中,平均多态性的发生率分别为1.0%、2.1%、6.4%和10.8%[40].因此,在基因组重排过程中,重组体的多态性明显增加,这意味着基因组重排引起的基因组变异更丰富.

4　展　望

基因组重排是对整个生物体和复杂表型进行定向进化的有力方法.它需要有遗传多样性的来源,经过自然选择或者人工诱变获得突变菌株,然后利用递归原生质体融合以及有效地筛选得到重组子.这种技术能允许基因组中不同位点的基因同时重组,因此多个基因的交换和重组可以快速而有效地发生,从而产生大量突变株,然后可以对所需的表型进行筛选[41].

与传统育种技术相比,基因组重排技术在改良菌株中省时省力,并且更为高效等独特优点[1].但迄今为止,基因组重排过程中目的融合子的筛选方法是目前限制这一技术应用的瓶颈,尤其是重组片段大多来源随机,高效筛选获得目的菌株较为困难.已有文献提出利用高通量筛选的方法,能对大量的融合子进行简单、快速的筛选,但是高通量筛选这一方法距离广泛应用还有很远距离[42].因此,菌株快速筛选的方法依旧需要不断地改进与完善.

现今的育种研究中,可将基因组重排技术与代谢工程结合使用获得具有优良表型的目的菌株.例如先通过代谢工程提高菌株次生代谢产物的产量,然后和基因组重排技术相结合,再对突变菌株进一步优化,从而获得优良的目的菌株;也有学者利用基因组重排首先获得具有理想表型的菌株,然后利用发酵工程对菌株进一步优化获得目的菌株[26].因此,在今后的研究中可将基因组重排技术与生物工程上的多种技术相结合使用[43],为生物产业提供更多的所需的目的改良菌株,让这项技术能够得到更广泛的应用.