降脂养阴方对高脂血症大鼠降脂作用机制研究

姜厚望，李思琪，闫玉冰，吴巧敏，柴欣楼*

（1.北京中医药大学，北京 100029；2.北京中医药大学东方医院，北京 100078）

高脂血症是一种发病隐匿的内分泌疾病，可由不良生活饮食习惯以及先天遗传等因素导致血脂过高而成[1]。直至2015年，我国成人患有高脂血症人群占总人口40.4%，并且呈现逐年增高的趋势[2]。血脂过高，导致血管淤堵，日久引发一系列心脑血管疾病。临床上，高脂血症病人往往会伴有脾虚湿困、倦怠乏力等症状，提示该类病人伴有脾虚症状[3-4]。目前，该类疾病动物实验中往往采用长期饲喂加入抗甲状腺激素药物的丙硫氧嘧啶与高脂饲料来获得稳定的高脂血症大鼠模型[5-6]，该模型属于中医脾虚症状。降浊养阴方由黄精、虎杖等中药组成，其中虎杖降浊祛瘀、黄精补气养阴，使脾建湿祛，脉络通达[7-8]。本实验通过研究降脂养阴方对高脂血症大鼠的降脂作用，来探究其改善高血脂的药理机制，为临床治疗高脂血症提供新的思路。

1　实验材料

1.1实验动物 SPF级雄性SD大鼠60只，体质量（150±10）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号码：SCXK（京）2012-0001。饲养于北京中医药大学动物房，SPF级别，许可证号码：SYXK（京）2011-0024。

1.2试剂 降浊养阴方（虎杖等4味中药）购于北京中医药大学东方医院；胆固醇（北京普博欣生物科技有限责任有限公司）；吐温-80（GeneBio）（批号为bw-t0014），蛋黄粉（GeneBio）（批号为bw-0517），多聚甲醛（批号lot161214），医用乙醚（20150106）均购于北京百诺威生物科技有限公司；丙硫氧嘧啶（上海朝晖药业有限公司，国药准字H31021082），立普妥（辉瑞制药有限公司，国药准字H20051407）；熟猪油（自制）；蒸馏水。

1.3实验仪器 东芝120全自动生化分析仪；全自动血流变分析仪；HH-2数显恒温水浴锅，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；Centrifuge 5810R低温高速离心机；Eppendorf移液枪；1.5 mLEP管（AXYGEN）（批号311-08-051）。

2　实验方法

2.1脂肪乳剂制备 按照猪油30 g，胆固醇5 g，蛋黄粉5 g，丙硫氧嘧啶1 g，吐温-80 ℃，5 mL，加蒸馏水定容至100 mL，在80 ℃温度下水浴搅拌充分混溶形成高脂乳剂。

2.2动物分配 所有大鼠适应性喂养1周后按体质量随机分为6组（空白组，模型组，中药高、中、低剂量组以及阳性药组），并均给予普通饲料喂养，正常提供饮用水。模型组和用药组均以2 mL/100 g高脂乳剂进行灌胃，持续6周；而空白组则给予等剂量生理盐水灌胃，1次/d。在喂养高脂乳剂2周后，在造模各组中选取3只大鼠进行腹主动脉取血，离心取血清，测定血清TC水平，根据TC升高判定造模是否成功。从实验第3周开始，各组大鼠造模方法不变，同时给予空白组、模型组2 mL/100 g生理盐水灌胃；中药高、中、低剂量组按照相当于生药的7.5、2.5和0.38 g/kg 灌胃给药；阳性药组按照5 mg/kg给予立普妥，灌胃剂量为2 mL/kg。给药时间持续4周。实验在第7周停止。

2.3宏观指标采集与处理 每日观察大鼠的活动情况、毛色的变化，并观察抓起时粪便和尿液颜色的变化。在造模第1周每天称重，第2周后每隔1周称1次重量。取材前3天每组选取6只拍照记录大鼠的毛发、耳朵以及足底颜色变化。拍照时拍照部位和Casmatch国际标准色卡同时拍照，并用Adobe Photoshop分析计算出二者的RGB值，其中R、G、B分别代表了红、绿、蓝3种原色，用拍照部位的RGB值分别与标准色标的RGB值相除，得到RGB的相对比值，以消除不同时间外界光线的差异对拍照部位RGB值的影响[9]。

2.4取材与样本处理 第7周最后1天取材，取材前1天禁食12 h。取材时将大鼠用10%水合氯醛麻醉（0.35 mL/100 g），腹腔注射。腹主动脉采血，血液分装于肝素钠抗凝采血管、EDTA抗凝采血各3 mL，2 h内送样检测血液流变学和血常规相关指标，以保证血液样品的新鲜；剩余血液分装于普通采血管中，4℃静置12 h，4 ℃，3 000 r/min离心15 min取上层血清，分装于1.5 mL EP管中，上机检测血脂以及血清学相关指标。

2.5胸主动脉病理指标 大鼠处死后，腹主动脉取血后，剪开胸骨，暴露胸腔。分离心脏、肺脏、食管，找到贴于胸椎伴行的血管即为胸主动脉。用弯头眼科剪挑起，将其与胸骨钝性分离；用眼科钳夹住，剪下，放入4%多聚甲醛溶液中固定。石蜡包埋后切片进行HE染色，光镜下观察肝脏病理变化。

2.6统计学处理 采用SPSS 20.0统计学软件进行统计学分析处理。数据结果以均数±标准差（± s ）表示。多组间呈正态分布且方差齐时采用单因素方差分析LSD多重比较方法，否则采用非参数检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

3　实验结果

3.1大鼠宏观表现 造模后大鼠的毛发脏乱，喜好聚堆绻卧，活动度低，对抓起反抗差，尿黄，便溏，体臭，符合中医脾虚证型的宏观表征[10]。给药后大鼠与模型组相比的毛发改善，对声响，抓起反抗较强，食欲增加，便溏状态有所改善。

3.1.1大鼠毛发颜色变化 肉眼观察，正常组大鼠毛发整洁光滑，造模后大鼠的毛发散乱，黏连。给药后，复方高剂量组大鼠毛发情况改善最为明显；阳性药组大鼠的毛发颜色与正常组相近，但仍较为散乱，有黏连。对R、G、B值进行统计学分析发现，与正常组相比，造模后大鼠的毛发R、G、B值均显著降低，其中B值降低最多，对应颜色明显偏灰。给药后高剂量改善效果最明显，R、G、B值均有显著升高，对应颜色也接近于正常组；阳性药组大鼠R、G、B值恢复，对应颜色偏白。说明复方可以明显改善高脂大鼠的毛发状态。

表1　各组大鼠毛发RGB值比较（± s ，n = 6）

表1　各组大鼠毛发RGB值比较（± s ，n = 6）

注：与正常组比较，# P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05

组 别　R　G　B空白组　0.92±0.02　1.07±0.03　1.08±0.03模型组　0.63±0.03#　0.73±0.04#　0.66±0.03#高剂量组　0.81±0.03#△　0.94±0.05#△　0.93±0.06△#中剂量组　0.72±0.06#△　0.81±0.07#△　0.77±0.08#△低剂量组　0.70±0.04#△　0.81±0.07#△　0.77±0.08#△阳性药组　0.93±0.06△　1.09±0.07△　1.10±0.75△

3.1.2大鼠足底颜色变化 肉眼观察，正常组大鼠足底颜色明亮偏红，而模型组大鼠足底略暗淡偏紫，但肉眼差异不明显；给药后，高剂量组大鼠的足底颜色略有好转，而阳性药组颜色恢复。对RGB值进行统计学分析发现，与正常组相比，造模后大鼠的足底R、G、B值均显著降低，其中B值降低最多，对应颜色明显偏紫。给药后高剂量组改善效果最明显，R、G、B值均有显著升高，对应颜色与正常组相比稍浅；阳性药组大鼠R、G、B值恢复，对应颜色比高剂量组偏红。说明复方可以明显改善高脂大鼠的足底皮肤颜色。

表2　各组大鼠足底RGB值比较（± s ，n = 6）

表2　各组大鼠足底RGB值比较（± s ，n = 6）

注：与正常组比较，# P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05

组 别　R　G　B空白组　0.85±0.05　0.86±0.07　0.97±0.08模型组　0.72±0.04#　0.69±0.05#　0.76±0.05#高剂量组　0.80±0.05△　0.79±0.06△　0.87±0.07△中剂量组　0.74±0.02#　0.73±0.02#　0.82±0.03#低剂量组　0.67±0.04#△　0.65±0.04#　0.75±0.05#阳性药组　0.84±0.03△　0.82±0.03△　0.92±0.05△

3.1.3大鼠耳朵颜色变化 肉眼观察，正常组大鼠耳内侧颜色偏红，血管清晰可见，造模后大鼠耳朵颜色变白并且肉眼血管不可见。给药后大鼠血管可见，其中高剂量组效果最明显，耳朵颜色有所恢复，可见较为清晰的血管；阳性药组大鼠耳朵与模型组相比颜色没有改变，微小血管不可见且耳缘有黄褐色变化。对RGB值进行统计学分析发现，与正常组相比，造模后大鼠的耳R、G、B值均显著升高，其中G值升高最多，对应颜色明显偏变白、亮。给药后高剂量改善效果最明显，R、G、B值均有显著降低，对应颜色与正常组相近；阳性药组大鼠R、G、B值没有变化，对应颜色与模型组相比偏暗。说明复方可以明显改善高脂大鼠的耳朵颜色以及血液供给情况，而阳性药并不能改善大鼠的耳朵颜色以及血供情况。

3.2对血清脂质的影响 造模6周后，与空白组比较，模型组大鼠的TC、HDLC、LDLC均升高，并且差异具有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，阳性对照组、复方高剂量组和低剂量组大鼠的TC、LDL-C水平均降低，且差异具有统计学意义。高剂量组比低剂量组降脂效果明显，TC、HDLC、LDLC分别降低20%、8.6%、26%，并且差异具有统计学意义（P＜ 0.05）；说明高剂量复方具有显著的降脂作用，但效果不及阳性药阿托伐他汀。各组大鼠的血脂变化见表4。

3.3对大鼠体质量的变化 造模6周后，与空白组相比，造模各组大鼠均生长缓慢。从第4周开始，复方高剂量组体质量与模型组相比增加明显，且具有统计学意义。到第6周，高剂量大鼠体质量与模型组相比已经有明显改善。阳性药组大鼠的体质量也发生明显变化，并且与模型组相比差异有统计学意义。但造模后的大鼠体质量均低于空白组大鼠。说明复方可以明显改善大鼠的体质量减轻的状态，其中高剂量效果明显。造模后大鼠体质量增长缓慢，提示和造模中加入丙硫氧嘧啶密切相关。见表5。

表3　各组大鼠耳朵RGB值比较（± s ，n = 6）

表3　各组大鼠耳朵RGB值比较（± s ，n = 6）

注：与正常组比较，# P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05

组 别　R　G　B空白组　0.83±0.04　0.78±0.07　0.83±0.07模型组　0.91±0.02#　0.93±0.05#　0.92±0.05#高剂量组　0.82±0.04△　0.79±0.07△　0.80±0.07△中剂量组　0.88±0.02△　0.86±0.05#　0.87±0.06低剂量组　0.88±0.02#△　0.91±0.03#　0.91±0.03#阳性药组　0.91±0.02#　0.94±0.03#　0.98±0.04#

表4　各组大鼠造模后六周血脂水平比较（± s ，n = 10）　　　　　　mmol/L

表4　各组大鼠造模后六周血脂水平比较（± s ，n = 10）　　　　　　mmol/L

注：与正常组比较，# P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05

组 别　TC　TG　HDL-C　LDL-C空白组　1.52±0.33　0.40±0.09　0.59±0.14　0.27±0.59模型组　5.94±0.63#　0.44±0.19　1.40±0.44#　1.96±0.19#高剂量组　4.75±1.13#△　0.43±0.09　1.28±0.18#　1.45±0.42#△中剂量组　5.65±0.89#　0.38±0.10　1.36±0.18#　1.87±0.39#低剂量组　5.17±0.71#△　0.37±0.08　1.31±0.17#　1.69±0.38#△阳性药组　3.05±0.85#△　0.27±0.06#△　1.21±0.30#　0.72±0.25#△

表5　各组大鼠造模后6周体质量变化值（± s ，n = 10）　　　　　　　　g

表5　各组大鼠造模后6周体质量变化值（± s ，n = 10）　　　　　　　　g

注：与正常组比较，# P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05

组　别　第0周　第2周　第4周　第6周空白组　195.9±5.56　330.8±21.18　417.9±39.03　459.8±51.57模型组　194.3±5.31　268.8±10.30#　250.2±14.57#　255.1±17.87#高剂量组　192.9±6.50　275.2±20.46#　273.4±27.94#△　278.2±30.19#△中剂量组　199.4±7.80　276.9±17.28#　270.5±24.10#△　268.2±25.44#低剂量组　200.4±6.75　278.4±14.74#　262.5±14.54#　263.6±17.52#阳性药组　202.5±7.60△　295.4±22.33#△　288.8±39.15#△　285.2±33.29#△

3.4对血清其他生化指标的影响 造模6周后，与空白组相比，模型组的ALT呈现增高的趋势，但差异无统计学意义；模型组AST降低明显，差异有统计学意义。给药后ALT、AST均有所降低，高剂量组对ALT、AST效果明显。说明复方对大鼠肝功能有一定的保护作用，且高剂量效果明显。见表6。

3.5对红细胞和白细胞的影响 造模6周后，与正常组相比，造模大鼠的血常规各项指标均没有明显变化。给药后复方高剂量可以明显升高大鼠血液中的单核细胞数；中剂量可以明显降低血小板数量和升高血红蛋白含量，说明复方可能具有降低血液黏稠度、降低贫血症状的发生。但高剂量没有体现该作用，可能是与药物的配比以及给药的剂量有关。见表7。

3.6对胸主动脉的影响 各组大鼠胸主动脉内均未发现动脉粥样硬化斑块，且弹性较好。动脉周围没有脂肪组织黏连。胸主动脉行HE染色后，光镜下显示空白组大鼠血管壁3层结构明显，内膜光滑，内皮下无脂质沉积；中膜可见完整弹力板，外膜存在；内膜、中膜和外膜分界清楚，管腔内有单层内皮细胞覆盖，细胞完整。造模各组大鼠血管壁3层结构可见，但是平滑肌层变薄，内膜和内弹力板均有不同程度的增厚、断裂，管腔内单层内皮细胞出现破损，其中模型组的断裂破损程度最为严重；中膜弹力膜清晰，平滑肌排列紊乱，并且有泡沫细胞与脂质颗粒沉积。与模型组相比，复方高剂量组对内皮的修复作用最为明显，内膜破损情况减少，单层内皮细胞相对完整；中膜脂质沉积减少，泡沫细胞数量减少，平滑肌层有所增厚。说明高剂量复方可以改善大鼠胸主动脉内皮的破损状态，减少其脂肪沉积，修复断裂的弹力板，恢复平滑肌层厚度。见图1（插页一）。

表6　各组大鼠造模后6周ALT、AST变化值（± s ，n = 10）　　　　　　　　　　U/L

表6　各组大鼠造模后6周ALT、AST变化值（± s ，n = 10）　　　　　　　　　　U/L

注：与正常组比较，# P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05

组 别　ALT　AST空白组　51.89±11.76　194.44±66.45模型组　72.89±36.86　133.67±56.67#高剂量组　68.60±8.75#　109.00±11.99#中剂量组　79.90±16.60#　120.70±19.79#低剂量组　70.44±14.37#　107.44±17.04#阳性药组　85.30±41.26#　126.30±43.16#

表7　各组大鼠造模后6周相关血细胞变化值（± s ，n = 10）

表7　各组大鼠造模后6周相关血细胞变化值（± s ，n = 10）

注：与正常组比较，# P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05

组 别　白细胞数（×109/L）淋巴细胞数（×109/L）单核细胞数（×109/L）中性粒细胞数（×109/L）血小板数（×109/L）红细胞数（×1012/L）　血红蛋白/（g/L）空白组　4.60±1.89　3.78±1.54　0.28±0.11　0.54±0.28　1150.4±122.2　6.91±0.28　136.80±6.75模型组　4.83±2.53　3.62±1.92　0.41±0.28　0.81±0.53　1248.7±148.3　7.05±0.34　136.90±8.05高剂量组　4.80±1.42　3.22±0.87　0.54±0.28#　1.02±0.53#　1289.4±247.8　7.05±0.30　136.78±10.00中剂量组　3.70±1.26　2.70±0.97　0.40±0.16　0.61±0.20　999.1±101.6#△　7.09±0.26　148.33±2.06#△低剂量组　4.46±1.80　3.24±1.21　0.41±0.19　0.81±0.52　1082.0±196.7△　7.01±0.34　142.50±7.67阳性药组　5.86±2.01　4.95±1.84　0.46±0.28　0.44±0.26　1011.3±191.4#　6.78±0.26　139.70±6.29

4　讨论

高脂血症是动脉粥样硬化、心肌梗死、脑梗死以及主动脉夹层等心脑血管疾病的重要致病因素[11]，同时也会诱发糖尿病、脂肪肝、内分泌功能紊乱等一系列并发症[12]。高脂血症在中医文献中没有对应记载，但多归属于血瘀、痰浊范畴。《素问·通评虚实论》中曾记载：“凡治消痹、仆击、偏枯萎厥，气满发腻，甘肥贵人，则膏粱之族也。”说明高脂血症的发生与饮食关系密切[13]。《灵枢》中也曾记载：“五谷之津液，和合而为膏者，以填补于骨空之中，则为脑为髓，为精为血。”[14]说明饮食中的精微物质经脾胃运化生成血脂，在肾的气化、肝的疏泄和肺脏的宣发作用下，由心气推动，输布到全身各个组织器官。但如果五谷精微化失其正，则会瘀阻脉络，形成痰浊。久而久之使津液停聚，气机不通，气郁化火，火热灼津，津聚生痰，产生瘀堵，血中的膏脂排泄不利，生成痰瘀等病理产物，壅塞脉道，混于血中，使血液黏度增高。而不断瘀积的痰浊会浸淫脉络，导致脉管损伤，从而加重病情进展。中医临床上对于高脂血症的辨证分型多为痰浊内阻、脾虚湿盛、气滞血瘀等几个方面[15]，治疗手段也是从利湿化痰、补脾渗湿、活血行气等方面入手[16-17]。但临床中会发现肥胖病人多有肝体亏虚，水不涵木，木失条达[18]。陈士铎曾说：“肝克土也，而肝木非土又何以生，然则木未尝不能生土，土得木以疏通则土有生气也。”[19]因此肝木既能从“克”的角度制约脾土，也能从“生”的角度滋生脾土，是脾土不至于运化过度，也不会出现亏虚。因此临床上应该多注意病人肝脏的疏泄状态。况且胆汁是“肝之余气”，其分泌水平决定体内外源摄入胆固醇的水水平[20]。因此通过养阴的手法来使肝气条达，可以作为临床治疗高脂血症的新思路。

降浊养阴复方含有虎杖、黄精等4味中药，虎杖降浊祛瘀，利湿退黄；黄精补气生津，肺脾肾同调，共奏补气健脾，祛瘀行气的功效。本实验从宏观与微观指标共同验证降浊养阴复方对高脂血症大鼠具有降脂功效，其中高剂量对TC与LDL的效果明显，并且可以改善大鼠食欲，增加体质量。同时可以降低血清ALT与AST的水平，改善肝脏状态。本实验造模方法是采用通用的含有丙硫氧嘧啶的高脂乳剂进行造模。该方法是抑制大鼠甲状腺素的合成，使大鼠处于甲状腺功能低下的水平[21]。但是长期服用丙硫氧嘧啶可能会造成肝脏损伤以及贫血[22]，因此在实验中笔者通过宏观指标与血清学指标来验证造模是否符合要求。造模后大鼠的血清总胆固醇明显升高。并且毛发脏乱、黏连，活动度减弱，足底偏紫，耳缘发白，出现血瘀、血虚的表现。血液指标发现，肝脏有损伤外，造模后的大鼠并没有出现血红蛋白降低，贫血的情况出现。说明造模比较符合临床要求。给药后，大鼠腹部、足底以及耳缘的颜色均有改善，其中高剂量效果最好。而中剂量可以明显降低血小板数量和升高血红蛋白含量。说明复方不仅具有降脂功效，也可能在降低血液黏稠度，增加血红蛋白浓度有一定作用。从病理切片发现中药复方在降低脂质浸润、恢复血管内膜完整性，维持动脉结构完整性有很好的效果[23]。但实验中还有一些不足，例如造模后大鼠的体质量均降低，与临床情况有差别，这可能是由于实验用大鼠年龄偏小，处于生长期，丙硫氧嘧啶抑制程度过高导致大鼠体质量减少。建议之后做实验可以选用成年大鼠。同样，中剂量表现出的降低血液黏稠度，增加血红蛋白浓度的作用提示可以更改药物的剂量来寻找合理的配比，以挖掘复方潜在的药理作用。