鹿茸多肽蛋白的提取及功能研究

高 冷，王昊天，牛晓晖，杨富雅，吕思丞，高晓晨

（1.长春工业大学，长春 130012；2.长春中医药大学，长春 130117）

鹿茸是雄鹿软骨形态没有形成坚硬骨质形态的嫩角，自古以来就是我国名贵的中药。《本草纲目》中曾有记载，鹿茸能生精补髓， 养血益阳， 强筋健骨，鹿茸中含有多种生物活性物质， 能够有助于受损机体的愈合调节作用，能促进新陈代谢，预防和治疗多种疾病[1]。但是鹿茸的化学和药理学研究并不深入，无法确定鹿茸的准确服用剂量和其能治疗的病症[2]。目前已知对生物细胞组织有效果的物质为多肽和蛋白质，而鹿茸中50%以上是蛋白类物质[3]。然而传统的热提取方法对鹿茸蛋白破坏较大，严重影响了鹿茸的药用功能，因此，寻找到一种更好的方法来提取，不但能提高鹿茸蛋白的药性，还能节省原料[4]。本研究通过用不同的方法来提取鹿茸多肽蛋白并加以比较，确定较佳的提取工艺，并对提取的鹿茸蛋白进行蛋白酶酶解处理，之后对鹿茸多肽蛋白的抗感染效果进行研究[5]。

1　实验材料

1.1原料 鹿茸样品取自长春双阳梅花鹿场4年生梅花鹿；碱性蛋白酶购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司；中性蛋白酶购自北京奥博星生物技术有限公司；胃蛋白酶购自中国盛世生物有限公司；NIH3T3细胞来自中国科学院长春应用研究所。

1.2实验仪器 冷冻干燥机购自北京松原华兴科技发展有限公司，旋转蒸发仪购自上海豫康科教仪器设备有限公司，超声提取机购自 宁波新芝生物科技股份有限公司。

2　实验方法

2.1超声法提取鹿茸蛋白 分别称取1 000 g、2 000 g、3 000 g新鲜鹿茸剥皮，用切片机切成1～2 cm厚的薄片。称取一定量鲜鹿茸放入超声仪器中，并加入50%的酒精水溶液直至没过鹿茸5～10 cm，在20℃的温度下超声24 h。之后过滤，将滤液放入旋转蒸发仪中浓缩，为保证不发生蛋白变性影响实验，温度一般选在80℃以下。将滤液浓缩到1 L左右后取出，倒入托盘中，放入干燥箱80℃干燥直至水分完全蒸干，取出用粉碎机磨粉过80目筛，称重并密封保存[6]。

2.2CO2超临界萃取法提取鹿茸蛋白 新鲜鹿茸剥皮切片，称重后放入- 40℃冰箱冷冻24 h。待其冷冻完全，放入冷冻干燥机干燥24 h，直至鹿茸切片发白，水分少于3%停止干燥。用粉碎机粉碎成粉，并过80目筛，放入CO2超临界萃取装置萃取桶中。在以压力为20 mPa，温度为20℃，流速为20的条件下萃取，得到鹿茸蛋白。

2.3细胞复苏 把冷冻好的细胞从- 80℃的冰箱中迅速取出，将其放置在恒温水浴锅中，水温为细胞适宜的37℃，等到冻存管内的液体融化完全后，将其加入15 mL的离心管中，同时把4 mL细胞培养液缓缓加入离心管中，再将装好细胞的离心管放入离心机中，设置转速为1 000 r/min，离心5 min，把1 mL培养液用移液枪加入，并向其吹匀，将细胞放于培养皿中，培养皿中加入9 mL培养液和1 mL血清。

2.4细胞传代 等到培养皿的80%以上都铺满所培养的细胞后，弃掉培养皿中全部的培养基，向其中加入胰酶2 mL，在37℃的条件下，让其消化2～5 min，降解细胞之间结合处蛋白，使之不再黏连贴壁，向其加入1 mL血清和3 mL培养基用移液枪吹起，将其加入到15 mL的离心管中，并放入离心机离心，将沉淀用3 mL培养液吹起，把它们分成3份，分别放入3个培养皿中培养。

2.5细胞冻存 1 mL冻存体系为500 µL血清、400 µL培养液和100 µL DMSO。冻存液要在实验之前配置好，现用现配。把已经不在黏连的细胞放置于冻存液当中，之后放于- 20℃冰箱存储冷冻2 h，然后将其转到- 80℃冰箱中。

2.6MTT实验 1）接种细胞[7]，单个细胞悬液的配置，须由10%胎小牛血清的培养液配成，并将其接种到96孔板中，其中每孔中有1 000～10 000个细胞，每个孔的体积是200 µL。2）培养细胞，培养细胞生长，直到其黏连贴壁，在每个孔中加入各种鹿茸多肽蛋白，其质量为5 mg，之后培养24 h。3）呈色，培养细胞24 h后，每个孔中加MTT溶液（用5 mg/mL PBS配制，pH = 7.4）20 µL，连续培养4 h。之后停止培养，小心吸出孔内的培养液上清液，并将其弃掉，若发现孔中有细胞悬浮，则需要将其以1 000 r/min离心5 min，之后再吸出孔内培养上清液。每孔中加入150 µL DMSO，振荡10 min，能充分融解孔内的晶体物质。4）比色，波长的选择为490 nm，测定各孔的吸光度，测试仪器为酶联免疫检测仪。把时间设为横坐标，纵坐标为吸光值来绘制细胞生长曲线。

2.7NIH3T3细胞实验[8]1）将NIH3T3细胞分到96孔板中，每孔各加入105个NIH3T3细胞，之后在向每孔中加含10%胎牛血清的半DMEM培养液200 µL，之后放置在CO2培养箱中，以温度设为37 ℃、CO2浓度设为5 %，在此条件下培养24 h。2）吸出上清液，并向每孔中加入包含浓度为0.5%胎牛血清的培养液200 μL，之后放置在CO2培养箱中，培养温度为37 ℃、CO2浓度为5 %，在此条件下培养24 h。3）把终浓度为1 mmol/L的阿司匹林加入各孔中，之后放置在CO2培养箱中培养，培养温度为37 ℃、CO2浓度为5%，在此条件下培养30 min。4）丢弃掉上清液，用PBS液（200 μL）冲洗每个孔，之后向每个孔中加入200 μL的10%血清半DMEM培养液，以温度为其最适宜的37 ℃、CO2浓度为5%的培养环境下培养3 h。5）向每个阳性对照孔中分别加入相同质量的罗非昔布，阴性对照组不给药,加药孔分别加入不同质量的鹿茸水解总蛋白、胃蛋白酶水解鹿茸蛋白、中性蛋白酶水解鹿茸蛋白和碱性蛋白酶水解鹿茸蛋白（0.5、1、2.5、5 mg），37℃、5%CO2环境下培养30 min。6）分别向每个孔中加入终浓度为2 µmol/L的花生四烯酸溶液，以温度为37 ℃、CO2浓度为5%的培养环境下培养15 min。7）与ELISA试剂盒操作相同。

2.8PGE2 分泌量检测 1）样品制备：吸取加鹿茸多肽蛋白的细胞培养基上清液50 μL。2）加样：各设置空白孔（空白对照孔不加入样品和酶标试剂）、标准孔和待测孔。在标准品孔中精确加入50 μL的标准样品，将50 μL待测样品加入待测孔中。样品需加入酶标板的底部，尽量不触及孔壁，轻轻摇晃，使其充分混合[9]。3）温育：用 封板模封板后置于37 ℃温育30 min。4）配液：将浓缩30倍的洗涤液用蒸馏水稀释30倍后，放于一旁备用。5）洗涤：小心揭掉封板模，丢弃掉其中液体，甩干，向每个孔中加入洗涤液直至加满，静置30 s后弃去洗涤液，如此往返重复5次，拍干。6）加酶：向每个孔中加酶标试剂各50 μL，空白孔不加。7）温育：用封板模封板后置于37 ℃温育30 min[3]。8）洗涤：小心揭掉封板模，丢弃掉其中液体，向每个孔中加入洗涤液直至加满，静置30 s后弃去洗涤液，如此往返重复5次，拍干。9）显色：先将50 μL显色剂A分别加入每一个孔中，然后向每孔中再加入50 μL显色剂B，之后将两者轻轻震荡使其混合均匀，将其置于37 ℃条件下避光显色15 min[2]。10）终止：将50 μL终止液分别加入每个孔中以终止反应 （此时溶液会由蓝色变成黄色）。11）测定：以空白孔为零，波长为450 nm，测量各孔的吸光度。测定须在各孔加终止液后15 min内进行。

3　结果

3.1鹿茸蛋白提取结果比较 见表1～2及图1。

如表1及图1所示，在其它条件相同的条件下，其中CO2超临界萃取提取率要略高于用超声法提取鹿茸蛋白，提取率高1.0%，所以较佳的提取方法是CO2超临界萃取法提取鹿茸蛋白。

3.2鹿茸多肽蛋白抗感染效果 见表2。

表1　超声法与CO2超临界萃取法提取鹿茸蛋白提取率

图1　超声提取与CO2超临界萃取提取率

如表2所示，用体外的细胞实验表明，检测NIH3T3细胞生成的PGE2浓度来计算鹿茸多肽蛋白的抗感染效果，并将其与罗非昔布进行对比。发现鹿茸多肽蛋白在以NIH3T3 为实验模型时，当干粉给药20 mg时，与阳性药物罗非昔布抗炎效果相当，50 mg时鹿茸多肽蛋白的抗感染效果要高于罗非昔布。

表2　鹿茸多肽蛋白抗感染效果检测（NIH3T3细胞）　pg/mL

表3　各酶解鹿茸多肽蛋白抗感染效果检测（NIH3T3细胞）　　　　　　　pg/mL

如表3及图2所示，NIH3T3体外实验表明，NIH3T3生成的PGE2浓度可以折算成其抗感染效果，计算并将其与罗非昔布进行对比。各酶解鹿茸蛋白在给药20 mg时，酶解鹿茸蛋白抗感染效果：酶解鹿茸总多肽蛋白>中蛋白酶酶解鹿茸多肽蛋白>胃性蛋白酶酶解鹿茸多肽蛋白>碱性蛋白酶酶解鹿茸多肽蛋白。在所有酶解鹿茸多肽蛋白中，酶解鹿茸总多肽蛋白抗感染效果要好于其他媒介鹿茸多肽蛋白。

图2　酶解鹿茸蛋白提取物细胞抗感染效果检测（NIH3T3细胞）

3　讨论

在超声波法取鹿茸多肽蛋白和CO2超临界萃取法提取鹿茸蛋白的实验中较佳的提取方法是CO2超临界萃取法，其较之超声法提高率高，提取率有显著差异。NIH3T3体外实验表明，检测NIH3T3细胞生成的PGE2浓度来计算鹿茸多肽蛋白的抗感染效果，并将其与罗非昔布进行对比。各酶解鹿茸蛋白在给药5、10 mg时，酶解鹿茸总多肽蛋白的抗感染效果不明显。但是各酶解鹿茸蛋白在给药20 mg时，酶解鹿茸蛋白抗感染效果：酶解鹿茸总多肽蛋白＞中蛋白酶酶解鹿茸多肽蛋白＞胃性蛋白酶酶解鹿茸多肽蛋白＞碱性蛋白酶酶解鹿茸多肽蛋白，酶解鹿茸总多肽蛋白抗感染效果要好于其他媒介鹿茸多肽蛋白。