参附汤治疗AngⅡ致心肌细胞肥大机制研究

李丽静，陈思慧，薛光辉，钱 圳，戴璐斌，周凯旋，赵国宏，马 悦，马晓彤，贡济宇，刘 佳

（长春中医药大学，长春 130117）

AngⅡ是一种寡肽类激素，是RAAS的重要组成部分，通过RAAS过度激活，使心功能失代偿，从而出现慢性心力衰竭的临床症状[1]。本部分首先筛选AngⅡ损伤心肌细胞的最佳实验时间和剂量，然后研究参附汤对AngⅡ损伤心肌细胞存活率、搏动频率、相关基因Caspase-3、Beclin1和Atg5表达量的影响。

1　实验材料

1.1实验试剂 乌拉坦，国药集团化学试剂有限公司产品；灭菌用水，天津药业集团新郑股份有限公司产品；DMEM高糖培养液，胎牛血清（FBS）均为HyClone公司产品；D-Hank’s平衡盐溶液，Genview公司产品；青霉素-链霉素溶液，上海碧云天生物技术有限公司产品；胰蛋白酶1：250、II型胶原酶、PBS缓冲溶液均为北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司产品；二甲基亚砜（DMSO），L-谷氨酰胺，AngⅡ，美国Sigma公司产品；噻唑蓝（MTT），生工生物工程（上海）股份有限公司产品；台盼蓝，上海恒远生物科技有限公司产品；LDH试剂盒、CCK-8试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司产品；RNA提取试剂盒、逆转录RT PCR试剂盒、染料法荧光定量试剂盒，宝生物工程（大连）有限公司产品。

1.2实验动物 65只健康SPF级SD大鼠，体质量220～240 g，雌雄各半，购自辽宁省长生生物技术有限公司，许可证号：SCXK(辽)-2010-0001。

1.3实验药物 参附注射液，批准文号：国药准字Z51320632，规格：10 mL/只，由雅安三九药业有限公司提供，临床静脉推注人用量5～20 mL/次，大鼠给药剂量是临床等效剂量的5倍[2]。参附汤水煎液的制备：按前期研究得出的参附汤治疗急性心力衰竭最佳配伍比例为人参：附子＝1：2，加10体积的水，浸泡过夜，煎煮1 h/次，共3次，将上清液滤过合并，浓缩人参生药至1 g/mL，用以备用[3]。

1.4实验仪器 十六道生理记录仪（MP-150），美国Biopac公司产品；生理信号采集分析系统（BL-420F），小动物呼吸机（HX-300S），成都泰盟科技有限公司产品；电子天平（JY4001），上海精密科学仪器有限公司产品；注射泵（MP-2003），上海雷恩医疗器械有限公司产品；台式低温高速离心机（GL-21B），上海飞鸽仪器厂产品；酶标仪（Model 680），伯乐生命医学产品（上海）有限公司；分析天平（FA604A），上海精天电子仪器有限公司产品；全自动脱水机（TP1020），组织包埋机（EG1150H），石蜡切片机（RM2235），摊片机（HI1220），干片机（HI1210），自动染色机（Autosainer XL）均为德国莱卡产品。

2　实验方法

2.1心肌细胞的活性测定及培养 取新生72 h乳鼠10只，剪取心室部分，放入装有D-Hank’s液的无菌玻璃平皿中，置于玻璃消化管口处[4]。将消化管放入37 ℃恒温水浴，加入组织消化液，反复吹打消化，循环5～6次。直至消化完全，即玻璃消化管中无可见组织块为止[4]。经200目过滤网过滤，通过差速贴壁的方法分离心肌细胞和成纤维细胞。利用台盼蓝排斥实验可用于测定细胞的活性，用细胞计数板分别对无色透明的活细胞和蓝染的死细胞进行计数[5]。根据公式计算活细胞率，活细胞率大于95%，方可达到细胞学实验研究条件。

当活细胞率大于95%，用DMEM高糖培养液（含10%胎牛血清）培养至所需浓度，接种于孔板中继续培养。接种后每隔48 h/次换培养液，换液时用PBS洗去死细胞。若培养液配制超过一周，则需要加入少量谷氨酰胺。一般第3～4 d即可见部分细胞伪足出现搏动并充分伸展，培养至第6天细胞伪足连接成片并呈现统一的自主搏动，可用于实验。

2.2AngⅡ致心肌肥大细胞的药物剂量和时间筛选 在96孔培养板中，每空100 μL细胞悬液，设1个正常细胞组、1个空白对照组和8个阿霉素组，每组6个复孔。正常细胞组每孔加入100 μL高糖DMEM培养基，阿霉素组分别加入100 μL不同浓度的阿霉素高糖DMEM，使阿霉素终浓度分别为0.25、0.5、1、2、4、8、16、32 mg/L。加药后继续培养4、12、24、48 h。实验结束时每孔加入10 μL MTT溶液继续在37℃，5%CO2培养箱中培养4～6 h。待显微镜下可见明显的蓝紫色甲臜颗粒后，每孔加入150 μL DMSO终止反应，震荡培养箱震荡10 min至甲臜颗粒完全溶解[6]。在490 nm波长下，用酶标仪测定各孔吸光度值（值）。按照生长抑制率公式计算不同浓度阿霉素对心肌细胞的生长抑制率。

2.3心肌细胞存活率的测定

2.3.1分组及给药 1）正常细胞组（Sham）：10%胎牛血清的DMEM；2）AngⅡ损伤细胞组（AngⅡ）：含终浓度为10～6 mol/L AngⅡ的10%胎牛血清的DMEM；3）参附汤含药血清：含终浓度为10～6 mol/L AngⅡ的10% 5 min含药血清的DMEM。

2.3.2MTT法测定细胞存活率 方法同2.2。

2.3.3CCK-8试剂盒检测细胞存活率 接种于96孔板后，每孔加入CCK-8溶液，37℃孵育4 h。在450 nm波长下，酶联免疫检测仪测定各孔吸光度值（OD值）。计算细胞存活率。

2.4自主搏动频率的影响 将调整浓度为1×105mL的差数贴壁心肌细胞，接种于6孔培养板中，每孔2 mL细胞悬液。培养致第6天时，弃去原培养液，用PBS清洗细胞3次。将细胞分为6组，各有6个复孔，每孔加相应溶液2 mL，在荧光倒置显微镜下观察给药前、给药后1、2、3、7、10、24 h的搏动频率。

2.5相关基因Caspase-3、Beclin1和Atg5的表达测定

2.5.1细胞总RNA的提取 按照宝生物工程大连有限公司提供的RNA提取试剂盒说明书，提取各组细胞总RNA。

2.5.2引物设计 采用primer 510软件设计Caspase-3、Beclin1和Atg5引物序列。基因上游引物（5’→3’）下游引物（5’→3’）基因Caspase-3上游引物（5’→3）GCTGGACTGCGGTATTGAG下游引物（5’→3’）CCTGGAACATCGGATTTGATT基因Beclin1上游引物（5’→3’）GGCAGTGGCTCCTATT下游引物（5’→3’）GGCGTGCTGTGCTCTGAAAA基因Atg5上游引物（5’→3’）AGTGGAGGCAACAGAACC下游引物（5’→3’）GACACGAACTGGCACATT基因β-actin上游引物（5’→3’）CTGTATGCCTCTGGTCGTAC下游引物（5’→3’）TGATGTCACGCATTTCC。

2.5.3cDNA的合成 将抽提的RNA为模板按照宝生物工程大连有限公司cDNA试剂盒说明书，操作合成cDNA。

2.5.4Real Time PCR 依据宝生物工程大连有限公司Real Time PCR 试剂盒说明书，进行Real TimePCR操作。

2.6统计学方法 采用SPSS 21.0统计学软件，进行多组间差别用单因素方差分析（One-Way ANOVA）进行相应的统计，组间两两比较用方差分析后的LSD检验[7]。

3　实验结果

3.1MTT法筛选心肌细胞肥大的药物剂量和时间 采用 MTT法检测 AngⅡ终浓度为10-8、10-7、 10-6、10-5、10-4mol/L作用于心肌细胞12、24、48、72 h对乳鼠心肌细胞的促肥大作用。结果显示：作用时间为48 h、作用浓度为10-6mol/L的AngⅡ对心肌细胞的促肥大作用最为明显，有显著性差异（P＜0.05），且AngⅡ对心肌细胞的促肥大效应呈时间-剂量依赖型5%[8]。根据实验结果，确定建立以终浓度为10-6mol/L的AngⅡ溶液作用乳鼠心肌细胞48 h的心肌细胞肥大模型。结果见表1。

表1　不同浓度AngⅡ不同作用时间下心肌细胞存活率（± s ，n = 5）

表1　不同浓度AngⅡ不同作用时间下心肌细胞存活率（± s ，n = 5）

浓度/（mol/L）心肌细胞存活率/%12 h　24 h　48 h　72 h 0　100.00±0.00100.00±0.00100.00±0.00100.00±0.00 10-8　98.64±6.75　94.38±5.37　93.63±5.27　91.63±6.84 10-7　90.05±5.32　93.44±4.52103.49±3.31　92.54±4.63 10-6　105.49±5.23114.28±6.90128.62±4.94104.73±6.04 10-5　104.97±1.39　99.73±2.74　96.75±4.38　89.01±3.90 10-4　53.37±2.58　64.81±2.63　76.55±3.88　79.27±3.86

3.2心肌细胞存活率的影响 由实验结果可见，与空白组对比，模型组心肌细胞存活率明显下降（P＜0.01），参附汤含药血清和血中移行成分均能够提高AngⅡ损伤乳鼠心肌细胞的存活率（P＜0.01），但不同时间含药血清之间无差异，不同含量血中移行成分见无显著性差异。见表2。

表2　参附汤对AngⅡ损伤心肌细胞存活率的影响（± s ，n = 10）

表2　参附汤对AngⅡ损伤心肌细胞存活率的影响（± s ，n = 10）

注：与ADR组比较## P＜0.01

组 别　MTT　CCK-8正常组　99.54±5.74##　98.88±4.77##AngⅡ组　62.57±7.93　61.66±6.97 SFY 组　91.54±1.77##　91.79±2.14##

3.3自主搏动频率的影响 由实验结果可见，AngⅡ对心肌细胞搏动频率具有增加的作用，在24 h和48 h最为显著（P＜0.05或P＜0.01），而在造模后48 h参附汤含药血清5 min和血中移行成分5%对这种异常的搏动频率有明显的抑制作用（P＜0.05）。结果见表3。

表3　参附汤对AngⅡ损伤心肌细胞自主搏动频率的影响（± s ，n = 5）

表3　参附汤对AngⅡ损伤心肌细胞自主搏动频率的影响（± s ，n = 5）

注：与ADR组比较，# P＜0.05，## P＜0.01

组 别　加药前　加药后0 h　24 h　48 h　72 h正常组　88.07±13.08　90.17±13.13　90.51±13.51#　93.17±14.07##　93.51±15.13 Ang Ⅱ组　89.55±11.60　95.97±12.28　110.20±10.24　123.62±12.91　102.60±14.76 SFY 组　91.08±10.17　93.67±11.99　95.83±13.20　97.17±16.01#　95.45±18.12

3.4参附汤含药血清及血中移行成分对AngⅡ损伤乳鼠心肌细胞的相关基因Caspase-3、Beclin1和Atg5表达的影响 模型组Caspasee-3、Beclin1和Atg5的mRNA表达量明显升高（P＜0.01或P＜0.001），而参附汤含药血清和血中移行成分可以抑制这种 mRNA表达量的升高（P＜0.05或P＜0.01）。结果见表4。

表4　参附汤对AngⅡ损伤心肌细胞凋亡及自噬相关基因mRNA表达的影响（s）

4　小结

本实验通过MTT、CCK-8法对细胞存活率的测定，筛选出建立心肌细胞肥大模型的最佳条件剂量为10-6mol/L、损伤时间为48 h。发现AngⅡ可以使心肌细胞的存活率明显降低，各给药组均可以提高AngⅡ损伤心肌细胞的存活。AngⅡ可以使心肌细胞自主搏动频率增加，在作用24 h和48 h时呈现出显著性差异，各组药物在不同时间均可以抑制AngⅡ致心肌细胞自主搏动频率的升高，其中SFP在作用48 h时表现出有显著性差。参附汤含药血清及血中移行成分组可降低细胞搏动频率和抑制Caspase-3、Beclin1和Atg5的表达。推测参附汤对AngⅡ导致的心肌肥大细胞具有保护作用，其机制是通过抑制细胞自噬和凋亡。