肝纤维化模型小鼠肝组织环状RNA表达谱分析

周玉平，吕雪幼，璩辉，朱林文，叶国良，郭俊明

（1.宁波大学医学院附属医院 消化内科，浙江 宁波 315020；2.宁波大学医学院 生物化学与分子生物学研究所 浙江省病理生理学技术研究重点实验室，浙江 宁波 315211）

环状RNA（circular RNA，circRNA）是近年来非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）领域最新的研究热点。circRNA是一类通过特殊剪切产生的ncRNA分子，大量存在于真核细胞，具有一定的组织、时序、疾病特异性，在疾病的发生发展中发挥着重要的调控作用[1]。circRNA对肝纤维化的发生发展是否具有调控作用目前尚不明确。因此，本研究采用circRNA芯片技术分析肝纤维化模型肝组织的circRNA表达谱，并用生物信息学方法分析差异表达circRNA的可能生物学功能，以期从circRNA角度解析肝纤维化的发病机制，为肝纤维化研究提供新的方向和思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：SPF级C57BL/6雄性小鼠，体质量为（20±2）g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2016-0006，饲养及实验在宁波大学医学院实验动物中心进行，并获得宁波大学动物伦理委员会批准同意。

1.1.2 主要试剂和仪器：四氯化碳（CCl4）分析纯（上海国药集团），橄榄油化学纯（上海国药集团），苏木精（美国Sigma公司），丽春红（美国Sigma公司），苯胺蓝（美国Sigma公司），Trizol（美国Invitrogen公司），核酸外切酶RNase R（美国Epicentre公司），ds-cDNA合成试剂盒（美国Invitrogen公司），ds-cDNA标记试剂盒（瑞士NimbleGen公司），2×PCR master mix（美国Arraystar公司），Gene Amp PCR System 9700（美国Applied Biosystems公司），ViiA 7 Real-time PCR System（美国Applied Bio

systems公司），Mouse circular RNA Array V2.0芯片（美国Arraystar公司），分子杂交仪（美国Agilent公司），Scanner G2505C芯片扫描仪（美国Agilent公司）。小鼠PCR引物由上海英骏生物技术有限公司合成，序列见表1。

1.2 方法

1.2.1 动物造模和肝组织采集：实验小鼠随机分为正常对照组、模型组，每组各8只。模型组按体质量以15% CCl4-橄榄油溶液2 mL/kg，腹腔注射，每周3次，正常对照组不处理，5周末采集小鼠肝脏组织。先用3%戊巴比妥钠以5 mL/kg腹腔注射麻醉小鼠，打开腹腔，观察肝脾大体形态，经下腔静脉采血，迅速切取肝脏最大叶，放入4%多聚甲醛中固定用于石蜡切片组织学观察；其余肝叶投入液氮中速冻，转入-80 ℃长期保存备用。

表1 PCR所用引物序列

1.2.2 组织病理学观察：常规制备肝组织石蜡切片行HE染色和Masson染色，观察组织炎症和胶原增生情况。Masson染色后光学显微镜下可见胶原纤维呈蓝色，肌纤维呈红色，细胞核成蓝褐色。组织切片由2位病理专家盲法进行阅片。

1.2.3 ds-cDNA合成、标记与杂交：cicrRNA芯片分析由上海康成生物有限公司完成。正常对照组和模型组小鼠随机取3例，分别提取肝组织总RNA，先用RNase R消化总RNA，去除线性RNA，富集circRNA，将富集的circRNA采用随机引物转录，扩增为荧光标记的cRNA探针，cRNA探针与Arraystar Mouse circRNA Arrays V2（8x15K）芯片进行杂交。

1.2.4 cicrRNA芯片数据分析：采用Agilent Scanner G2505C扫描芯片，Agilent Feature Extraction software（version 11.0.1.1）软件分析结果。2组样本间差异表达的circRNA通过变化倍数和P值进行筛选，将变化倍数＞2倍，P＜0.05视为差异表达。将筛选出的差异circRNA绘制散点图，并对所得数据进行监督性层次聚类分析。每条circRNA均用美国Arraystar公司的微小RNA（microRNA，miRNA）结合位点预测软件mirTarget预测5个高匹配值的miRNA结合位点。

1.2.5 RT-qPCR：Trizol法提取肝组织样本总RNA，并测定RNA的纯度和浓度，经反转录反应合成cDNA模板，将master mix预混液、模板、上/下游引物、ddH2O配制成PCR反应溶液，进行PCR扩增反应，设置参数如下：95 ℃ 10 min预变性；40个PCR循环（95 ℃ 10 s；60 ℃ 60 s）。以GAPDH为管家基因，标准曲线法计算目的基因的相对表达量。每个样本重复3次实验。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS20.0软件进行分析。数据以±s表示，2组间比较采用两独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组小鼠肝组织病理学观察 HE染色显示，正常对照组小鼠肝小叶结构清晰，肝细胞索由中央静脉向四周放射排列，中央静脉、汇管区动静脉和胆管结构正常；模型组肝细胞广泛坏死，正常肝小叶结构消失，可见大量的炎性细胞浸润。Masson染色显示：正常对照组小鼠仅在汇管区和中央静脉见少量胶原纤维；模型组肝组织胶原广泛增生，由汇管区向四周放射延伸，部分形成大小不一的完整假小叶结构。见图1。

图1 2组小鼠肝组织HE染色（×200）和Masson染色（×100）结果

2.2 cicrRNA芯片筛查结果 cicrRNA芯片筛查结果显示，共检测到10 389个cicrRNA，与正常对照组相比，模型组肝组织差异表达的circRNA共有69个，其中上调2倍以上的有14个，下调2倍以上的有55个；上调4倍以上的有1个，下调4倍以上的有5个，结果见表2和图2A。监督性分层聚类分析显示，差异表达的circRNA能正确区分模型组和正常对照组，见图2B。

2.3 差异cicrRNA的RT-qPCR验证 综合芯片结果的差异倍数高、组内样本一致性好、circRNA类型等因素，选取其中差异倍数4倍以上，属于外显子（exonic）类型的5个circRNA作为目标circRNA，进行RT-qPCR验证，结果显示，5个circRNA变化趋势与芯片结果一致，其中4个差异有统计学意义（P＜0.05），见图3。

表2 差异表达4倍以上的circRNA

图2 利用散点图和热图分析circRNA表达谱变化

2.4 cicrRNA作用的靶miRNA的预测 运用mirTarget软件对上述5个cicrRNA进行分析，得到可能与之相互作用的miRNA（见表3）。对这些miRNA进行文献检索分析发现，miRNA-338-3p[1]、miRNA-141[2-3]与肝纤维化发生机制有关。

表3 生物信息学分析预测的可能与circRNA相互作用的miRNA

图3 部分差异circRNA的肝组织RT-qPCR验证

3 讨论

circRNA相关研究进展迅速，已有的研究证实circRNA的生物学功能至少包括以下几个方面：miRNA海绵作用、调控基因转录、调控RNA结合蛋白等[4]。其中，miRNA海绵作用最受关注，研究表明，外显子来源的circRNA表面存在miRNA的反应元件（microRNA response element，MRE），能特异性结合miRNA，调控下游基因的表达[5]。目前对于circRNA与疾病的研究主要集中在肿瘤领域。circRNA与肝脏疾病的研究目前报道不多，已有的研究主要是关于原发性肝癌circRNA诊断标志物的发现[6]。此外，还有研究发现，circRNA与非酒精性脂肪肝及肝再生机制有关[7-8]。circRNA与肝纤维化的相关研究则鲜有报道。最近，CHEN等[9]报道circRNA与肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）活化有关，初步探讨了circRNA与肝纤维化的关系。

本研究采用高通量芯片初步研究了经典的CCl4肝纤维化小鼠模型肝组织的circRNA的表达谱变化，结果显示，部分circRNA在模型组肝组织中表达明显变化，提示circRNA可能与肝纤维化进展有关。根据芯片结果的差异倍数高、组内样本一致性好，我们选取部分差异circRNA进一步进行了RT-qPCR验证和生物信息学功能预测，结果发现，mmu_circ_42398、mmu_circ_42397、mmu_circ_34116的靶miRNA（包括miR-338-3p、miR-22-3p、miR-141-5p）与肝纤维化发病机制密切相关[1-3，10]，本研究结果提示，circRNA与肝纤维化发生和发展过程存在一定关联，circRNA可能通过miRNA分子海绵作用，参与肝纤维化的进展，但还需要进一步验证。