高、低侵袭性肝癌干细胞模型的建立及生物学特性鉴定

黎运呈，曾芳，丁贤君，李世波

（1.舟山医院 感染科，浙江 舟山 316000；2.舟山市妇幼保健院 产前诊断实验室，浙江 舟山316004）

肝癌是成人肝脏最常见的原发性恶性肿瘤，也是全世界最常见的恶性程度最高的实体瘤之一，其病死率位列第三[1-2]。在同一类型的肿瘤中，癌干细胞（cancer stem cells，CSCs）仍然具有异质性且可能存在不同侵袭转移能力的CSCs亚群。有学者推断肝癌是肝癌干细胞（liver cancer stem cells，LCSCs）增殖和分化形成的肿瘤器官，LCSCs的残存是肝癌复发的根源，且至少部分肝转移癌的形成应当由LCSCs来完成[3]。有研究者认为LCSCs是肝癌组织侵袭、转移的基础和源头[4]。本研究拟在前期研究[5]基础上，以高迁移肝癌细胞系（HCCLM3）为研究对象，建立高侵袭性肝癌干细胞（high-invasion liver cancer stem cells，H-ILCSCs）和低侵袭性肝癌干细胞（low-invasion liver cancer stem cells，L-ILCSCs）模型并进行生物学鉴定，为肝癌侵袭和转移的研究探索新的方向。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂：NOD-SCID免疫缺陷鼠（6～8周龄）购自中国科学院上海实验动物中心（动物合格证号：20150005）。Mat-rigel胶和流式抗体购自美国BD公司。Transwell小室购自美国Corning公司。CCK-8试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司。CD133、CD44、CD90磁珠购自德国Miltenyi公司。B27购自美国Gibco公司，表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）购自美国PeproTech公司。

1.1.2 细胞培养：人高迁移肝癌细胞系HCCLM3、正常肝细胞HL-7702购自上海中国科学院典型培养物保藏中心，其中HL-7702细胞是第6代。肝癌细胞HCCLM3培养：DMEM培养基加10%胎牛血清；HL-7702培养：RPMI-1640培养基加10%胎牛血清；H-ILCSCs和L-ILCSCs培养：DMEM培养基98%，B27生长因子2%，再加入EGF/bFGF，使其终浓度为20 ng/mL。所有细胞均在37 ℃，5% CO2培养箱条件下培养。

1.2 方法

1.2.1 Transwell侵袭实验分离高、低侵袭性HCCLM3细胞：参照TIE等[6]的操作方法，首先分离得到高（下室细胞）/低（上室细胞）迁移能力的HCCLM3细胞。将高迁移能力的HCCLM3细胞悬液加到Transwell小室（涂Matrigel胶）上室，24 h后，取出下室细胞，获得高侵袭能力的HCCLM3细胞；将低迁移能力的HCCLM3细胞悬液加到Transwell小室（涂Matrigel胶）上室，24 h后，取出上室细胞，获得低侵袭能力的HCCLM3细胞。

1.2.2 免疫磁珠法分选获得H/L-ILCSCs：采用免疫磁珠分选法以CD133+为分子标志分离上述高、低侵袭性HCCLM3细胞中的干细胞。参照Miltenyi公司试剂盒说明书，将高、低侵袭能力HCCLM3肝癌细胞分别悬于500 μL的分选Buffer，制备成1×108/mL的单细胞悬液，然后在细胞悬液中加入CD133磁珠微粒100 μL，4 ℃避光孵育30 min，缓冲液冲洗细胞并离心，弃上清，重悬细胞进行H/L-ILCSCs分选。1.2.3 流式细胞仪检测H/L-ILCSCs表面标志分子：参考试剂盒说明书，以CD133+、 CD90+、 CD44+为LCSCs表面标志，将分选后的H-ILCSCs、L-ILCSCs、HCCLM3和HL-7702细胞用PBS洗涤2次后重悬，调整细胞密度为1×107/mL。实验组细胞分别加入CD133-PE、CD90-PE、CD44-APC等抗体5 μL，对照组分别加入同型对照抗体5 μL，混匀后4 ℃避光孵育30 min。加入PBS清洗细胞3次，多聚甲醛固定混匀，上机检测CD133+、CD90+、CD44+的表达量，实验组重复检测3次。

1.2.4 H-ILCSCs和L-ILCSCs的鉴定及侵袭特性分析：①CCK-8法检测生长增殖能力：收集H-ILCSCs、L-ILCSCs、HCCLM3和HL-7702细胞单细胞悬液，分别调整浓度至5×104/mL。取5块96孔板接种细胞，每孔加细胞悬液100 μL，每组设平行复孔3个。分别在6、12、24、36、48 h随机选取96孔板，10 μL的CCK-8试剂加入各孔，继续孵育4 h，酶标仪于波长490 nm处测定各孔吸光度值，并取平均值。②Transwell肿瘤侵袭实验：取分离得到的对数生长期H-ILCSCs、L-ILCSCs、HCCLM3和HL-7702细胞，将细胞浓度调整至1×105/mL，吸取250 μL细胞悬液，加入Transwell小室（涂Matrigel胶），上室加入含0.5%胎牛血清的DMEM培养基，下室加入含20%胎牛血清的DMEM培养基。每组细胞重复5个样本。37 ℃孵育48 h后，用棉签去除上层小室中未侵袭迁移的细胞。然后将侵袭至下层的细胞，先用70%甲醇固定10 min，空气干燥后，用0.1%结晶紫染色，并于显微镜下计数，计算PET膜下表面的侵袭细胞数，取5个视野计数平均值（%）。③平板克隆形成实验：取对数生长期H-ILCSCs、L-ILCSCs、HCCLM3和HL-7702，梯度倍数稀释细胞悬液，取含2 mL培养基的六孔板，每孔接种100个细胞，细胞吹散均匀后继续培养，每周换液2次，10 d后终止培养。弃上清后PBS洗2次，加4%多聚甲醛固定15 min。然后去固定液，加适量GIMSA染液染色20 min，计数大于10个细胞的克隆数。④免疫缺陷裸鼠体内成瘤实验：取对数生长期的H-ILCSCs、L-ILCSCs、HCCLM3和HL-7702细胞，消化吹散制成单细胞悬液，用不含血清的PBS洗2次后，PBS重悬。体内实验分为4组，每组6～8周龄的NOD/SCID裸鼠共3只。按照1:1的比例与Matrigel混合，分别皮下接种1×107/mL上述细胞，2周后开始测量，隔天观察1次。记录皮下移植瘤形成时间及生长速度，并测量瘤体的长径和短径。

1.3 统计学处理方法 应用SPSS13.0软件进行数据统计。所得数据用±s表示，实验重复至少3次。2组均数比较采用t检验，多组均数比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞CDl33+、CD90+、CD44+表面分子标志的表达 由表1可知，与正常肝细胞HL-7702相比，H-ILCSCs、L-ILCSCs、HCCLM3细胞表面标志分子CDl33+、CD90+、CD44+的表达差异均有统计学意义（P＜0.01）。H-ILCSCs和L-ILCSCs中CD133+细胞表达比例均在90%以上，说明免疫磁珠分选纯度很高。此外，CD133+细胞比例在H-ILCSCs和L-ILCSCs间差异无统计学意义（P＞0.05），而H-ILCSCs和LILCSCs中CD133+细胞比例均高于HCCLM3细胞（P＜0.01）。H-ILCSCs表面标志CD90+、CD44+的表达均高于L-ILCSCs和HCCLM3细胞，差异有统计学意义（P＜0.01）。而L-ILCSCs和HCCLM3细胞CD90+、CD44+的比例差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组细胞表面标志CDl33+、CD90+、CD44+的阳性表达率（n=3，±s，%）

表1 各组细胞表面标志CDl33+、CD90+、CD44+的阳性表达率（n=3，±s，%）

与HL-7702比：aP＜0.01；与HCCLM3比：bP＜0.01；与L-ILCSCs比：cP＜0.01

组别 CD133+ CD90+ CD44+H-ILCSCs 94.57±1.96ab 92.16±1.55abc 91.69±0.70abc L-ILCSCs 93.39±0.99ab 12.25±1.10a 10.88±1.64a HCCLM3 16.78±3.06a 10.51±1.44a 9.52±1.65a HL-7702 1.49±0.46 1.51±0.80 1.43±0.52

2.2 各组细胞的生长增殖能力 CCK-8法检测连续培养6、12、24、36、48 h后的吸光度值，结果显示：随着时间的延长，H-ILCSCs、L-ILCSCs、HCCLM3和HL-7702细胞的生长增殖能力逐渐增高；在相同的时间点，H-ILCSCs的吸光度值明显高于LILCSCs、HCCLM3、HL-7702细胞，差异有统计学意义（P＜0.05），HCCLM3的吸光度值明显高于L-ILCSCs和HL-7702细胞，差异有统计学意义（P＜0.05），而L-ILCSCs和HL-7702细胞生长增殖能力差异无统计学意义（P＞0.05）。因此，L-ILCSCs、HL-7702的增殖能力最弱，而H-ILCSCs的细胞增殖能力最强。见图1。

图1 H-ILCSCs、L-ILCSCs、HCCLM3和HL-7702细胞的生长增殖曲线图

2.3 各组细胞的侵袭能力 取相同细胞密度的H-ILCSCs、L-ILCSCs、HCCLM3和HL-7702细胞进行Transwell小室侵袭实验，结果发现，HCCLM3、HL-7702、H-ILCSCs和L-ILCSCs细胞平均穿膜数分别是209±36、44±12、488±6、45±8。H-ILCSCs的穿膜数是正常HCCLM3细胞的2倍多，是L-ILCSCs的近10倍，差异具有统计学意义（P＜0.05）。HCCLM3的穿膜数是L-ILCSCs和正常HL-7702细胞的近5倍，差异有统计学意义（P＜0.01）。而L-ILCSCs与HL-7702细胞的平均穿膜数差异无统计学意义（P＞0.05）。因此，HILCSCs侵袭转移能力最强，L-ILCSCs和HL-7702细胞的侵袭能力最弱，见图2。

2.4 各组细胞的克隆形成能力 分选后的H-ILCSCs、L-ILCSCs、HCCLM3和HL-7702细胞置于相应的培养基中培养。H-ILCSCs细胞悬浮生长，5～7 d后，可见数十个细胞呈球形聚集生长；随着培养时间的延长，球体逐渐增大，形态大小各不相同；到第10天时形成典型的肿瘤球，且相对致密。HCCLM3可以形成肿瘤球，但球体明显较少，且球块不大。而LILCSCs和HL-7702细胞未见肿瘤球形成。因此，在相同细胞密度下，H-ILCSCs的克隆形成能力明显高于HCCLM3细胞，而L-ILCSCs和HL-7702细胞不能形成肿瘤球。见图3。

图2 Transwell侵袭实验比较H-ILCSCs、L-ILCSCs、HCCLM3和HL-7702的侵袭转移能力（结晶紫染色，×200）

2.5 接种各组细胞的免疫缺陷动物成瘤能力 接种相同H-ILCSCs和HCCLM3细胞数量的裸鼠，在2周后可观察到开始形成移植瘤，成瘤率为100%，而接种L-ILCSCs、HL-7702细胞的裸鼠未见明显的瘤体。以1×107/mL细胞密度接种，H-ILCSCs和HCCLM3形成的移植瘤体积均随着时间增加而逐渐增大，而HILCSCs成瘤潜伏期相对要短，且生长速度更快。第1、第3、第5、第7、第9天测量时，HCCLM3形成的移植瘤体积均大于HCCLM3细胞，差异有统计学意义（P＜0.05）。说明H-ILCSCs相比HCCLM3、L-ILCSCs、HL-7702细胞具有更强的成瘤能力。见图4和表2。

3 讨论

上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在肿瘤发生、侵袭、转移和复发中起着关键作用，是上皮来源癌细胞获得侵袭和转移特性的过程。有学者[7-8]认为EMT与CSCs关系密切，分化成熟的癌细胞能够通过EMT获得干细胞特性。近年研究也报道，EMT与CSCs样特性获得存在密切关联，二者通过TGF-β、Notch、Wnt/β-catenin、FGF、PI3k/Akt、Hedgehog等多种信号通路及信号串话调控网络，促进了肿瘤的侵袭、转移及复发[9]。因此，本课题组采用Transwell侵袭小室，人工模拟EMT过程，从肝癌细胞HCCLM3中分离出高、低侵袭性肝癌细胞，培养富集后，以CD133+为表面标志进行磁珠分选，分别获得H-ILCSCs和L-ILCSCs细胞，并检测了H/L-ILCSCs干细胞表面标志物CD133+、CD90+、CD44+的表达情况，最后进一步与高迁移性肝癌细胞HCCLM3和正常肝细胞HL-7702相比较，鉴定其生长增殖、体外侵袭、平板克隆形成和体内裸鼠成瘤能力等生物学特性。

图3 H-ILCSCs、L-ILCSCs、HCCLM3和HL-7702在无血清培养基中肿瘤球的形成情况（GIMSA染色，×200）

图4 接种H-ILCSCs、L-ILCSCs、HCCLM3和HL-7702细胞的免疫缺陷动物的成瘤能力（移植1×107/mL细胞，成瘤后第9天观察）

表2 接种H-ILCSCs和HCCLM3细胞的免疫缺陷动物移植瘤体积比较（n=3，±s，mm3）

表2 接种H-ILCSCs和HCCLM3细胞的免疫缺陷动物移植瘤体积比较（n=3，±s，mm3）

与HCCLM3比：aP＜0.05，bP＜0.01

组别 第1天 第3天 第5天 第7天 第9天HCCLM3 102.18±40.40 174.54±92.45 215.88±123.45 366.73±163.63 585.60±69.62 H-ILCSCs 316.43±28.91a 507.40±27.95a 785.37±107.86a 1 086.16±106.02a 1 445.69±39.99b

分选后H-ILCSCs和L-ILCSCs细胞表面分子标志CD133+细胞比例分别为94.57%±1.96%和93.39%±0.99%，说明磁珠分选纯度很高。H-ILCSCs细胞表面标志CD90+、CD44+细胞比例分别为92.16%±1.55%和91.69%±0.70%，与HCCLM3和HL-7702细胞比较差异有统计学意义（P＜0.01），说明CD133+、CD90+、CD44+可以作为H-ILCSCs的分选标志物，这与BAHNASSY等[10]观点一致。此外，L-ILCSCs细胞CD133+细胞比例和H-ILCSCs组差异无统计学意义，而其CD90+、CD44+细胞的比例明显低于H-ILCSCs细胞，与HCCLM3细胞差异无统计学意义，说明L-ILCSCs表达低水平的干性相关分子CD90+和CD44+，LCSCs表面分子标志的表达可能具有异质性。这与WRIGHT等[11]的观点相同，他们在对Brcal基因缺陷乳腺癌小鼠的研究中发现，来源于该类乳腺癌的细胞中含有2种不同表型的CD44+/CD24-和CD133+亚群细胞，都具有CSCs样特征，且这2种表型的细胞没有重叠，推测CSCs具有异质性。

在增殖实验中，H-ILCSCs的吸光度值在作用相同时间时均较L-ILCSCs、HCCLM3、HL-7702细胞明显增高，体现了最强的体外增殖能力，而L-ILCSCs生长增殖能力明显低于HCCLM3细胞，与HL-7702细胞增殖能力无统计学差异，可见即使是同一种肿瘤内，CSCs可能存在不同增殖能力的亚群干细胞；在Transwell肿瘤侵袭实验中，H-ILCSCs侵袭转移能力最强，远高于L-ILCSCs、HCCLM3、HL-7702细胞，而L-ILCSCs侵袭能力明显低于HCCLM3细胞，与HL-7702细胞无统计学差异，可见，LCSCs中可能存在不同侵袭转移能力的CSCs亚群。这与BRABLETZ等[12]、HERMANN等[13]和VISVADER等[14]的观点类似，他们提出了静止性CSCs和转移性CSCs的概念，认为CSCs具有异质性，肿瘤发生和转移的主力“种子”是具有高侵袭和转移潜能的CSCs导致的，肿瘤转移是具有转移能力的CSCs内在特性的表现，它决定了恶性肿瘤的演进、复发和转移，而静止性CSCs负责维持原发瘤的生长，不具有迁移和侵袭能力。本研究平板克隆形成和免疫缺陷动物成瘤能力实验中，HILCSCs和HCCLM3细胞形成的移植瘤体积均随着时间的增加而逐渐增大，且H-ILCSCs裸鼠成瘤潜伏期相对较短，生长速度更快，形成的克隆球和移植瘤体积明显大于HCCLM3细胞，而L-ILCSCs未见体外克隆球和体内裸鼠成瘤形成，这进一步说明LCSCs具有异质性且可能存在不同侵袭转移能力的CSCs亚群，其中H-ILCSCs是专门负责肝癌细胞侵袭、转移的一部分CSCs，而L-ILCSCs成为非侵袭转移性CSCs。

综上所述，本研究发现HCCLM3细胞中可以分离和富集不同侵袭能力的CSCs亚群（H-ILCSCs和L-ILCSCs），且H-ILCSCs的干性特征高于L-ILCSCs，而L-ILCSCs干性特征低于HCCLM3细胞。因此，本研究认为LCSCs具有异质性，可建立更为可信的HILCSCs和L-ILCSCs模型，且二种LCSCs间存在着生物学特性的差异。在肝癌防治研究或药物筛选中，可通过靶向定位于H-ILCSCs，并力求将H-ILCSCs全部清除。