Treg/Th17对小鼠非酒精性脂肪性肝炎的影响研究

李伟平 吴巍 何卫美 吴国栋 朱伟华 左飞 周尾梅 刘江

非酒精性脂肪性肝病现已成为国人严重肝病之一，其包括单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）、肝纤维化、肝硬化等一系列的病理变化。NASH是非酒精性脂肪性肝病进展为肝硬化的限速步骤。“二次打击”学说认为，胰岛素抵抗引发的第一次打击导致脂肪变性的肝细胞对内、外源性损害因子的敏感性增强，发生炎症和坏死，触发二次打击，使疾病向肝纤维化、肝硬化进展[1]。肝脏炎症是NASH的明显特征，肝脏免疫应答可能在NASH的发病机制中扮演重要的角色。非酒精性脂肪性肝病患者存在慢性低水平的炎症，表现为血液循环中炎症因子水平升高和局部组织器官炎症细胞浸润，这种炎症的持续存在最终导致人体代谢紊乱和器官功能障碍。Treg细胞构成性表达高水平CD25分子和特征性表达转录因子Foxp3。Treg细胞主要分泌抗炎症因子IL-10、IL-35。Th17细胞是由初始T细胞在IL-6和IL-23的刺激下分化而成的辅助性T细胞，主要分泌IL-17、IL-22等促炎症因子。对乙型肝炎患者的一项研究表明，Treg/Th17比例降低是慢性乙肝炎症损伤和肝纤维化的促进因素[2]。本研究以高脂饮食诱导建立小鼠NASH模型，通过检测小鼠外周血Treg/Th17比例的变化，探讨Treg/Th17对NASH的影响，以期为寻找NASH的新治疗靶点提供参考。

1 材料和方法

1.1 实验动物与动物模型的建立 20只4～6周龄SPF级雄性C57BL/6小鼠购自上海西普尔必凯实验动物有限公司，体重18～20g。小鼠适应性喂养1周后开始实验，按随机数字表法分为模型组和对照组，各10只。对照组小鼠予普通饮食饲养10周。模型组小鼠予高脂饮食饲养10周，高脂饲料s3282购自美国Bioserv公司。10周后处死各小鼠留取外周血与肝组织，以备后序实验。

1.2 方法

1.2.1 肝组织病理学检查 取小鼠肝左叶，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋、切片，HE染色与Masson染色，光镜下观察组织病理学改变。参照美国国立卫生研究院NASH临床研究网病理工作组指南[3]，进行非酒精性脂肪性肝病活动度评分（NAS）和肝纤维化评分（FibroS），由2位病理科医师盲法阅片，取平均值作为最终评分。NAS＞4分视为小鼠NASH模型建立成功。

1.2.2 血清生化指标检测 取各小鼠外周血，检测TG、ALT、AST水平，按检测试剂盒说明书进行检测，试剂盒均购自南京生物建成有限公司，酶标仪检测。

1.2.3 Treg、Th17细胞检测 应用流式细胞仪检测Treg、Th17细胞。常规分离各小鼠外周血单个核细胞，调整细胞浓度至 2×107个/ml，与 FITC-CD4+、CD25、Foxp3 4℃避光孵育。PBS洗涤细胞，1%多聚甲醛悬浮。应用FACSVantage流式细胞仪（美国BD公司）检测，分析采用 CellQuest软件（美国BD公司），测定CD4+CD25+Foxp3+T细胞在CD4+T细胞和CD4+CD25 T细胞中的比例，计算Treg/Th17比例。

1.2.4 肝组织炎症因子水平检测 ELISA法检测小鼠肝组织炎症因子 NF-κB、IL-6、IL-10、IL-17 的表达，操作按试剂盒说明书进行，试剂盒均购自上海岚派生物科技有限公司。取各小鼠的肝组织1～2g，组织均匀混合后抽提组织蛋白并进行蛋白定量检测。设空白孔（不加样品和酶标试剂）、不同浓度梯度的标准品孔、待测样品孔，在标准品孔中加入50μl标准品，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，再加待测样品10μl。将样品加于酶标板孔底部，混匀；用封板模封板后37℃温育30min。揭掉封板模，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，重复5次，拍干。然后每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外，每孔先加入显色液A 50μl，再加入显色液B50μl，震荡混匀，37℃避光显色10min。最后每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。以空白孔调零，450 nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值），根据标准品浓度与OD值的标准曲线，计算待测样品的浓度，即炎症因子水平。

1.3 观察指标 （1）观察并比较模型组与对照组小鼠肝组织病理学变化；（2）比较两组小鼠血清TG、ALT、AST水平；（3）比较两组小鼠外周血 Treg/Th17比例；（4）比较两组小鼠肝组织炎症因子水平。

1.4 统计学处理 应用 SPSS16.0统计软件；计量资料以表示，组间比较采用两独立样本t检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组小鼠肝组织病理学变化比较 见图1（插页）。

图1 两组小鼠肝组织病理学变化比较（a：HE染色，×200；b：Masson染色，×400）

由图1可见，对照组小鼠肝组织HE染色与Masson染色显示肝脏组织结构无明显异常，未见到纤维化情况；模型组小鼠肝组织HE染色可见肝细胞脂肪变性，炎症细胞浸润，气球样变性，NAS评分＞4分，NASH模型成功建立，同时Masson染色可见轻、中度窦周纤维化或门静周围纤维化。模型组小鼠NAS、FibroS评分均高于与对照组[（4.70±0.82）分vs（0.00±0.00）分、（1.30±0.48）分 vs（0.00±0.00）分，均 P＜0.05]。

2.2 两组小鼠血清TG、ALT、AST水平比较 见表1。

表1 两组小鼠血清TG、ALT、AST水平比较

由表1可见，模型组小鼠血清TG、ALT、AST水平均高于对照组（均P＜0.05）。

2.3 两组小鼠外周血Treg/Th17比例比较 见图2。

由图2可见，模型组小鼠外周血Treg/Th17比例较对照组明显下降（0.72±0.05 vs 2.06±0.15，P＜0.05）。

2.4 两组小鼠肝组织炎症因子水平比较 见表2。

由表2可见，与对照组比较，模型组小鼠促炎因子NF-κB、IL-6、IL-17水平均升高（均 P＜0.05），而抗炎因子IL-10水平下降（P＜0.05）。

图1 两组小鼠肝组织病理学变化比较（a：HE染色，×200；b：Masson染色，×400）

图2 两组小鼠外周血Treg、Th17细胞流式细胞图

表2 两组小鼠肝组织炎症因子水平比较

3 讨论

Treg细胞与Th17细胞间存在复杂的相互作用关系，两者在功能上相互拮抗，在分化上却具有相关性，机体存在Treg/Th17平衡。IL-6能调控Treg/Th17的平衡，IL-6在转化生长因子β（TGF-β）存在的情况下诱导初始T细胞分化为Th17细胞，另一方面，TGF-β能够诱导Treg细胞的分化，而IL-6抑制能够抑制这个过程[4]。Treg/Th17失衡会导致多种自身免疫性疾病及肿瘤的发生、发展[5-6]。

NF-κB为转录因子蛋白家族，NF-κB被激活会促进NASH发生、发展。IL-6是肝细胞刺激因子，诱导急性期反应。IL-17是Th17细胞主要效应因子，能有效地介导组织的炎症反应。IL-10能够抑制前炎症细胞因子产生，减轻炎症。Treg细胞调节免疫应答的机制主要是分泌抗炎细胞因子IL-10、TGF-β、IL-35。NASH患者的血清促炎因子TNF-α、IL-6明显升高，而抗炎因子IL-4、IL-10明显降低[7]，提示Treg细胞缺失或功能缺陷在NASH炎症的发生、发展中具有重要作用。高脂饮食诱导的非酒精性脂肪性肝病小鼠由于氧化应激引起Treg细胞凋亡，减少了肝组织中Treg细胞的数量，减弱了其对炎症反应抑制，Treg细胞的变化可能是当肝脏经受二次或三次打击时，导致单纯脂肪肝向NASH转变的机制[8]。

然而，单纯性脂肪肝进展为NASH的研究发现，肝组织中的CD68+细胞和Treg细胞都明显升高[9]。也有研究发现，比较代谢异常的胰岛素抵抗肥胖者、代谢正常的胰岛素抵抗肥胖者以及体型消瘦者的脂肪组织中的T细胞特征，发现代谢异常的胰岛素抵抗肥胖者脂肪组织中Th17和Th22细胞数量增加，导致了引起肝脏代谢功能障碍的细胞因子产生增加[10]。Th17细胞和IL-17与肝脏脂肪变性和NASH的促炎反应以及促进单纯性脂肪肝进展为NASH等过程具有明显的关联[11]。因此，单纯研究Treg细胞、Th17细胞在NASH中的变化，难以阐明NASH免疫方面的机制。

对乙型肝炎患者的研究表明，Treg/Th17比例下降是慢性乙型肝炎炎症损伤和肝纤维化的促进因素[2]。同样，本研究结果显示，模型组小鼠Treg/Th17比例较对照组明显下降，导致了促炎因子与抗炎因子之间的失衡，促进NASH炎症及肝纤维化进展。最近，有学者发现熊去氧胆酸胶囊能够在一定程度上缓解NASH小鼠炎症的主要机制是改善Treg/Th17失衡及其相关的炎症反应[12]。

综上所述，Treg/Th17失衡参与了高脂诱导的NASH小鼠的发病机制。Treg/Th17失衡会导致促炎因子与抗炎因子之间的失衡，促进NASH炎症与肝纤维化的形成。其中具体的信号转导通路与机制尚需要进一步研究，以为NASH治疗寻求新的作用靶点。