三肽脯氨酸对大鼠蛛网膜下腔出血后脑神经细胞凋亡的影响

陈朝晖 洪溪屏 兰频 潘锋

细胞凋亡作为一种在凋亡相关基因调控下发生的程序性死亡过程，在蛛网膜下腔出血（SAH）后脑损伤过程中扮演着重要角色，凋亡神经细胞可通过释放诸如TNF和IL等炎性因子导致周围正常细胞坏死，因此，抑制SAH后脑神经细胞凋亡被认为是SAH治疗策略中的重要部分[1]。AMP激活的蛋白激酶（AMP-activatedpro-teinkinase，AMPK）通路是细胞能量代谢及氧化还原状态的双重超敏感受器，在SAH所诱导的早期脑损伤中发挥了重要作用[2]。三肽脯氨酸（tristetraprolin，TTP）作为串联锌指蛋白半胱氨酸-半胱氨酸-半胱氨酸-组氨酸（CCCH）级的成员，可在转录后水平调控许多促炎因子和生长因子，如 IL-6、IL-33、NF-κB和HIF-α等[3]，从而在调控细胞生长、凋亡和炎症反应等病理生理反应过程中发挥着重要作用[4]。但TTP对SAH后脑神经细胞凋亡的影响尚不明确，因此，笔者通过建立大鼠SAH模型，研究TTP对大鼠SAH后脑神经细胞凋亡的影响及其可能机制，为临床治疗SAH提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料 细胞蛋白提取试剂盒购自日本TaKaRa株式会社；大鼠TTP基因过表达质粒及对照质粒购自上海吉凯基因化学公司；TTP小干扰RNA（small interference RNA，siRNA）质粒及对照质粒购自上海锐博生物公司；Tunel试剂盒购自瑞士Roche公司；腺苷酸活化蛋白激酶（Adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase，AMPK） 激动剂 5-氨基咪唑-4-甲酰胺-β-D-呋喃糖苷（5-Aminoimidazole-4-carboxamide1-β-D-ribofuranoside，AICAR）购自美国 Sigma公司；TTP、Bax、Bcl-2和Caspase-3和β-actin抗体购自美国Epitomics公司；AMPK、LKB1、p-AMPK 和 p-LKB1 抗体购自美国Santa Cruz公司。

1.2 大鼠SAH模型建立 健康清洁级成年雄性SD大鼠120只，体重290～340g，购自中科院上海动物实验中心，所有动物实验均依照“NIH Guidelines of Care and Use of Laboratory Animals（2011）”标准进行，动物饲养于18～24℃恒温恒湿环境中，12h/12h光暗周期，实验动物均自由进食水。参考Bederson等[5]的血管内穿刺法制作大鼠SAH模型，应用10%水合氯醛对大鼠进行腹腔麻醉，将大鼠置于试验台上固定，颈部皮肤备皮和消毒后于颈部正中纵向切开，显露颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，用血管夹临时阻断颈总动脉和颈内动脉，在颈外动脉行一小切口，自切口将导管和钨丝插入颈外动脉，将导管缓慢推进至大脑前动脉和中动脉分叉处，将钨丝继续推进1～2mm，穿破动脉从而建立SAH模型。手术结束后，将大鼠置于恒温箱内并标记。

1.3 实验设计、分组及给药方式 将120只大鼠随机分为假手术（Sham）组（进行SAH模型建立相似手术操作，但不穿破动脉）、SAH组、TTP过表达对照（SAH+Vector）组、TTP过表达（SAH+TTP）组、TTP干扰对照（SAH+NC）组、TTP小干扰（SAH+siTTP）组、SAH+AICAR组和SAH+AICAR+TTP组，每组15只。所有药物均在SAH建模前24h通过立体定向仪经右侧侧脑室注射，注射坐标为：向后1.0mm，右侧旁开1.0mm，深度为4.5mm，注射完成后继续留针5min。Sham组大鼠注射0.9%氯化钠注射液10μl，SAH 组大鼠注射 0.9%氯化钠注射液 10μl，SAH+Vector组大鼠注射TTP过表达对照质粒10μl（5nmol/μl），SAH+TTP组大鼠注射TTP过表达质粒10μl（5nmol/μl），SAH+NC组大鼠注射TTPsiRNA对照质粒10μl（5nmol/μl），SAH+siTTP 组 大 鼠 注 射 TTP siRNA10μl（5nmol/μl），SAH+AICAR组大鼠注射AICAR 10μl（5μg/μl），SAH+AICAR+TTP组大鼠注射AICAR+TTP过表达质粒10μl（5μg/μl）。各组大鼠建模后24h经脊椎脱臼法处死后取右侧大脑半球脑组织进行下一步实验（实验过程中，Sham组大鼠无一只死亡，SAH组死亡3只，SAH+Vector组死亡2只，SAH+NC组死亡2只，SAH+TTP组死亡3只，SAH+siTTP组死亡3只，SAH+AICAR组死亡2只，SAH+AICAR+TTP组死亡4只）。

1.4 Tunel法检测脑神经细胞凋亡率 各组大鼠脑组织石蜡切片经脱蜡水化，每组标本按Tunel试剂盒说明书操作，每个样本滴加 50μl Tunel反应混合液，置于湿盒中37℃孵育1h，再添加DAPI核染，置于荧光显微镜（OLYMPUS,BX51TF）下选择视野拍片。神经细胞核染为蓝色即是Tunel阳性细胞，在400倍荧光显微镜下，随机选取5个视野，共计数200个细胞计算镜下阳性细胞所占比例。

1.5 Western blot检测脑组织蛋白的表达 大鼠脑组织加入细胞裂解液中，置于冰上反应30min，再在4°C条件下12 000r/min离心20min，收集上清液后使用BCA蛋白检测试剂盒对蛋白质浓度进行定量分析。蛋白质样品（30μg）使用10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳进行后转移到0.45 μm的硝酸纤维素膜上，并使用5%脱脂奶粉于4℃下孵育过夜，该膜在4°C与一抗 [TTP（1 ∶500）、Bax（1 ∶1 000）、Bcl-2（1 ∶1 000）、Caspase-3（1∶1 000）、β-actin（1∶1 000）、AMPK（1∶2 000）、LKB1（1∶1 000）、p-AMPK（1∶1 000）和 p-LKB1（1∶2 000）]在室温下反应30min后，在室温下与二抗再次孵育1h，ECL反应、曝光、显影。使用美国Nikon Spot图像采集处理系统采集图像，图像经Image-ProPlus 5.0专业图像分析软件分析条带并测量累积光密度值，以目的蛋白条带累积光密度值与β-actin条带累积光密度值之比表示。

1.6 统计学处理 应用SPSS 17.0统计软件，计量资料以表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TTP对大鼠SAH后脑神经细胞凋亡的影响 见图1。SAH组大鼠脑神经细胞凋亡率较Sham组明显增加，差异有统计学意义（P＜0.01）；与SAH+Vector组比较，SAH+TTP组中脑神经细胞凋亡率显著减少，差异有统计学意义（P＜0.01）；下调TTP在大鼠脑组织中的表达可增加大鼠SAH后脑神经细胞凋亡率，SAH+siTTP组和SAH+NC组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

图1 TTP对大鼠SAH后脑神经细胞凋亡的影响（*P＜0.05，**P＜0.01）

2.2 TTP在SAH大鼠中的表达 与Sham组比较，SAH组脑组织中TTP的表达显著下调，差异有统计学意义（P＜0.01）；与 SAH+Vector组比较，SAH+TTP组脑组织中TTP蛋白的表达明显上调，差异有统计学意义（P＜0.01），见图 2a、表 1；SAH+siTTP 组脑组织中 TTP 蛋白的表达较SAH+NC组明显下调，差异有统计学意义（P＜0.01），见图 2b、表 2。

图2 TTP过表达质粒及TTP siRNA对大鼠脑神经细胞中TTP表达的影响

表1 TTP过表达质粒对大鼠脑神经细胞中TTP表达的影响

表2 siTTP对大鼠脑神经细胞中TTP表达的影响

2.3 TTP对大鼠SAH后凋亡相关蛋白表达的影响 SAH建模24h后大鼠脑组织中Bax和Caspase-3的表达明显上调，而Bcl-2表达下调，与Sham组比较差异均有统计学意义（均P＜0.01），见图3a、表3；上调TTP在脑组织中的表达后可显著上调Bcl-2的表达，同时抑制Bax和Caspase-3的表达；SAH+siTTP组大鼠脑组织中Bax和Caspase-3的表达较SAH+NC组均显著上调，而Bcl-2表达下调（P＜0.05），见图 3b、表 4。

SAH建模24h后大鼠脑组织中p-AMPK和p-LKB1的表达明显上调，与Sham组比较差异有统计学意义；上调TTP在脑组织中的表达可抑制p-AMPK和p-LKB1的表达，SAH+TTP组与SAH+Vector组比较，差异有统计学意义（P＜0.01），见图 3c、表 5；AMPK 激动剂AICAR可显著诱导p-AMPK和Caspase-3在大鼠脑组织中的表达，并抑制TTP的表达，同时AICAR可逆转TTP对p-AMPK和Caspase-3的表达抑制作用，p-AMPK和Caspase-3在SAH+AICAR+TTP组中的表达均高于SAH+TTP组中的表达，差异有统计学意义（P＜0.01），见图 3d、表 6。

图3 TTP对大鼠SAH后脑细胞凋亡相关蛋白表达的影响

表3 TTP过表达质粒对Bax、Bcl-2和Caspase-3表达的影响

表4 siTTP后对Bax、Caspase-3和Bcl-2表达的影响

表5 TTP过表达质粒对p-AMPK和p-LKB1表达的影响

表6 AICAR对TTP、p-AMPK和Caspase-3表达的影响

3 讨论

SAH作为一类致死率和致残率极高的神经外科疾病，可导致脑细胞以炎性坏死、凋亡和自噬3种形式死亡，从而引起脑水肿、脑血管痉挛、炎性反应、血脑屏障破坏和肺水肿等一系列并发症[1]。研究表明SAH后诱发的早期脑损伤是导致患者死亡及神经功能障碍的最主要原因，且神经功能缺损程度与脑组织损伤过程中线粒体功能受损、能量代谢障碍和自由基的集聚直接相关[2]。细胞凋亡作为一种细胞程序性死亡方式，在SAH后早期脑损伤中扮演着重要角色，凋亡细胞可通过释放诸如TNF-α和IL-6等炎性因子从而影响周围正常细胞发生坏死。有研究表明，干预SAH大鼠海马区神经细胞凋亡，可有效改善SAH大鼠预后[6]。因此，抑制SAH后脑神经细胞凋亡被认为是SAH治疗策略中重要的一环[7-8]。目前，大鼠SAH模型的建立有枕大池注血法、视交叉注血法和血管内穿刺法3种[9]，而血管内穿刺法更适合研究大鼠SAH后早期脑损伤，为此，本研究通过血管内穿刺法建立大鼠SAH模型，并且观察到造模后大鼠脑神经细胞凋亡明显增加，与既往研究相似[10]。

TTP首次发现于ARE与TNF-α mRNA的交联中[3]，目前关于TTP作为一种mRNA破坏因子最明确的证据来自于对TTP敲除大鼠的观察，TNF-α mRNA在这种大鼠的巨噬细胞中表达显著上调，从而导致血液循环中TNF-α含量增加，进而引起全身炎症反应的多种症状[4]；另外在TTP敲除小鼠中也观察到诸如恶液质、侵蚀性关节炎、皮肤炎、结膜炎和肾小球肾炎等多种炎症反应[11]；另外改变TTP在机体中的表达对诸如类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮和溃疡性结肠炎等疾病的发生和严重程度起到非常重要的作用[12-13]。但目前尚未有TTP与SAH的相关性研究报道，本研究发现，TTP在SAH造模后表达下调，表明TTP有可能作为SAH后脑损伤发生的早期预测因子及治疗靶点。为进一步研究TTP在大鼠SAH中的作用，笔者通过经大鼠脑室注射TTP过表达质粒或TTP siRNA质粒的方法从而影响大鼠脑组织中TTP的表达，并通过Tunel法分析TTP在SAH后脑神经细胞凋亡中的作用，本次研究首次观察到大鼠注射TTP过表达质粒后可有效减少SAH后诱发的脑神经细胞凋亡，同时抑制Caspase-3的表达并降低Bax/Bcl-2比值，而注射TTP siRNA质粒后可起到相反的作用，从而表明抑制脑神经细胞凋亡在TTP发挥SAH后脑神经细胞保护作用中发挥了一定作用，而降低Bax/Bcl-2比值在TTP发挥脑神经细胞保护作用中可能起到一定作用。

研究表明，AMPK作为一种异源三聚体蛋白，由α催化亚基和β、γ调节亚基组成，AMPK可通过调节细胞的能量及代谢平衡，从而对细胞的生长及增殖产生调控作用，激活后的AMPK可通过调控mTOR、P13K和LKB1等一些在细胞能量代谢过程中的关键蛋白激酶，从而影响细胞凋亡[14-15]。在本研究中，SAH可显著上调AMPK及其下游因子LKB1的磷酸化水平，而上调TTP可抑制p-AMPK在脑组织中的表达，但TTP和AMPK在大鼠SAH过程中的互为因果关系尚不明确。为进一步明确AMPK通路在TTP抑制SAH后脑神经细胞凋亡中的作用，本研究将AMPK的特异性激活剂AICAR注射至大鼠脑室中，观察到单独应用AICAR可下调TTP及Caspase-3的表达，同时在AICAR存在的情况下，TTP对Caspase-3的下调作用也明显减弱，从而进一步表明抑制AMPK通路在TTP减少脑神经细胞凋亡过程中发挥着主要调控的作用。

综上所述，本研究表明TTP可有效保护大鼠SAH后脑神经细胞凋亡的发生，其抑制脑神经细胞凋亡的机制与抑制AMPK信号通路有关，从而为临床SAH治疗提供一个新的作用靶点，在揭示SAH的发病机制及治疗上具有一定积极意义。