细胞自噬研究方法的比较与分析

李志元， 张 欣

(中国科学院 合肥物质科学研究院 强磁场科学中心， 合肥 230031)

自噬是一种进化上保守的细胞内的降解行为，参与了很多生理和病理过程[1]。与其他降解系统相比，自噬最显著的特征是能降解细胞内几乎所有物质，如生物分子、细胞器甚至入侵的微生物[2]。比利时科学家Christian de Duve于1963年首次提出了自噬(autophagy)的概念，希腊语中auto意为self，phagy意为eat，因此autophagy意为自食(self-eating)[3]。尽管自噬概念已提出50多年，但是对自噬的深入理解起始于最近20年左右。早期的30年，属于自噬的缓慢发展阶段，以自噬生理功能的阐述及一些生化检测手段的建立为主。例如发现营养供给调控自噬[4]，蛋白磷酸化调控自噬[5]，并且筛选到了抑制自噬的化合物3-MA (3-Methyladenine)等[6]。直到20世纪90年代，Yoshinori Ohsumi利用酵母遗传学的手段鉴定了多种自噬相关基因(autophagy related gene,ATG)，如ATG1和ATG13，才开启了自噬分子机制调控的发展阶段[7]。同时Daniel Klionsky与Yoshinori Ohsumi合作，发现了Cvt (cytoplasm to vacuole targeting)途径[8]，随后Beth Levine克隆鉴定了哺乳动物中第一个自噬基因Beclin-1[9]，Yoshinori Ohsumi与Tamostu Yoshimori合作发现了哺乳动物中自噬体的标志物LC3-II(微管轻链相关蛋白3-II)[10]，这些先驱性的工作逐步开启了自噬研究的辉煌时代。

图1 自噬体形成过程[2]

目前已发现细胞内存在各种类型的自噬，如分子伴侣介导的自噬、微自噬和巨自噬。其中巨自噬即人们常说的自噬[11]，也是本文探讨的内容。在饥饿或化学刺激等因素的诱导下，胞质中首先形成隔离膜，随着隔离膜的延伸，待降解物质被包裹其中，最终闭合形成具有双层膜的自噬体(图1)[2]。自噬体外膜随后与溶酶体膜融合，利用其中的酸性水解酶来降解其内含物。自噬潮(autophagic flux)是表征自噬过程动态连续的概念，可以理解为一条流动的小河(自噬潮)来冲走河里的泥沙(需降解的内容物)，包括了从前期自噬体的形成到后期自噬性底物在自噬溶酶体中降解的整个过程，因此动态监测此过程能够准确地反映细胞内的自噬活性[1, 12-13]。

至今在酵母中发现的ATG基因已有30多种，很多在高等真核生物中都有其同源物。这些ATG基因编码的蛋白，目前可以分为6个主要功能组分：最上游的Atg1复合物(自噬起始复合物)、Atg9、III型PI3K复合物、Atg2-Atg18复合物、Atg12-Atg5-Atg16l交联系统以及最下游的Atg8-PE交联系统。这些复合物有序介导了自噬体的形成，并在真核生物中保守，因此又被称为自噬核心机器[2, 14]。关于自噬体的具体形成过程可参见其他相关综述[15]。

1 常用标志物、小分子化合物和自噬诱导方法

1.1 常用自噬标志物

LC3(Microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3)是酵母Atg8在哺乳动物中的同源物，贯穿于自噬体从形成到成熟的各个阶段，也是自噬研究中最常用的标志物。LC3主要以胞质和膜结合的两种状态存在，分别为弥散的胞质状态的I型LC3(LC3-I)和膜结合状态的II型LC3(LC3-II)。在自噬诱导时，LC3-I的C端在ATG4/ATG7/ATG3等酶的作用下，被磷脂酰乙醇胺(PE)修饰后转换成LC3-II。由于PE修饰后的LC3-II疏水性较强，尽管其分子量(16 ku)比LC3-I(14 ku)大，但是SDS-PAGE中LC3-II电泳迁移速率要比LC3-I快[1, 12]。LC3-II是目前使用最广泛、认可度最高的自噬标志物[1, 10-12]。除了内源性LC3作为自噬标志物以外，外源表达的荧光蛋白融合的LC3也经常被用于自噬研究中，如GFP-LC3、mRFP-GFP-LC3[16]，以及最近改进的mTagRFP-mWasabi-LC3等[17]。

除LC3之外，还有一些其他的自噬蛋白也经常被用作自噬标志物。例如在自噬体形成早期招募的重要蛋白WIPI2和ATG12-ATG5-ATG16L1等[11, 18]，以及选择性自噬中的自噬受体p62(sequestosome，SQSTM1)[19]。在选择性自噬中，自噬受体将特异性货物招募到自噬体降解[20]，而p62作为自噬受体其本身也同时作为自噬底物被降解，因此细胞内p62含量的升高或降低也是一个经常被用来检测自噬水平抑制或升高的标志物。

1.2 常用小分子化合物

由于作用的即时性和可逆性，小分子化合物被广泛应用于自噬研究。同时由于药物的时间和剂量依赖性，人们需要根据小分子化合物的不同剂量和处理时间来确定自噬的动态变化[21]。常用的小分子化合物包括直接参与自噬调控的PI3K、mTOR和ULK1等的抑制剂，以及针对于溶酶体活性的抑制剂等。

目前有多种针对自噬调控蛋白的抑制剂常用于自噬研究中，例如针对III型PI3K VPS34、I型PI3K激酶、mTOR和ULK1等的抑制剂等。对PI3K家族而言，I型PI3K抑制自噬，III型PI3K VPS34促进自噬，而不同抑制剂对不同亚型的特异性有所不同。例如，wortmannin和 LY294002对几乎所有PI3K亚型都有抑制作用[22]，SAR405和VPS34-IN1对VPS34特异性很高[23-24]，而GDC-0941对I型p110α有高度选择性[25]。除自噬外，VPS34也在内吞过程中发挥作用[23]，因此VPS34抑制并不能完全反映自噬活性的抑制。此外，由于ULK1调控自噬的起始和成熟，目前也有ULK1抑制剂MRT-68921和SBI-0206965被开发应用于自噬研究[26-27]。

由于抑制溶酶体可以直接影响自噬潮，多种溶酶体抑制剂包括chloroquine(CQ)，bafilomycin A1(Baf A1)，ammonium chloride (NH4Cl)和E64D+Pepstatin A等被广泛应用于自噬研究中。而不同小分子的起效时间不尽相同，例如NH4Cl较快，Baf A1较慢，而E64D+Pepstatin A则需要更长的时间[11, 28]。此外，对于Baf A1，其抑制细胞自噬的原理是通过抑制V-ATPase来提高自噬溶酶体的pH，以及抑制自噬体-溶酶体融合。但是Baf A1抑制V-ATPase的同时还会抑制mTORC1[29]，因此事实上也具有一些促进自噬的功能。同样地，CQ和NH4Cl在抑制溶酶体和自噬潮的同时，也具有促进自噬的功能[11]。因此，要综合使用不同的抑制剂来确定实验结果。

1.3 常用的自噬诱导手段

在生理状态下，多数细胞内的自噬水平很低。因此在自噬研究中，人们常常需要通过一些特定的方法来诱导自噬。例如，常用来促进自噬的有mTOR抑制剂rapamycin，Torin和AZD8055；多种饥饿方法，包括EBSS平衡盐溶液饥饿、血清饥饿、葡萄糖饥饿和氨基酸饥饿等[1, 11, 30]。需要注意的是，各种自噬诱导手段的诱导效果和途径各不相同。例如，rapamycin只能抑制mTORC1并且抑制效率并不高[31]，Torin1或Torin2不仅对mTORC1有很强的抑制作用，还可以抑制mTORC2[32]；而各种类型的饥饿是相对更有效的自噬诱导剂。

2 常用的细胞自噬检测方法

2.1 LC3 turnover实验

Western Blot检测内源性LC3-II变化以及辅助性检测SQSTM1/p62水平是检测细胞自噬的常用方法[10, 19]。然而，由于自噬是一个动态的过程，单检测LC3-II的静态水平并不能完全反映细胞内的自噬潮变化。例如，如果Western Blot显示细胞内LC3-II水平增加，实际上存在两种可能：1)自噬水平升高导致更多的LC3-II参与自噬体的形成；2)自噬潮后期受到抑制，导致LC3-II降解受到抑制。而为区分这两种可能，需要联合自噬后期抑制剂如溶酶体抑制剂Baf A1或CQ来比较LC3-II在抑制剂加入前后的变化差异，即LC3 turnover(图2)。在没有Baf A1时， a和c中LC3-II都升高，但是加入抑制剂后才能判断a是由于自噬活性增强，c是由于自噬降解活性降低；而b则表明自噬的前期诱导受到抑制(图2)[13]。而如果观测到细胞内LC3-II降低，同理也有两种可能：1)极快的自噬潮导致降解的LC3-II比产生的LC3-II多[33]，需要指出的是，这种情况目前报道的并不多；2)自噬起始阶段受到抑制，减少了自噬体的形成和LC3-II的水平[34]。此时也同样需要联合自噬后期溶酶体抑制剂来区分这两种可能，如果小分子化合物单独作用与联合溶酶体抑制剂后LC3-II差异不大，说明自噬起始阶段受到抑制；如果联合自噬抑制剂后LC3-II明显增加，说明自噬潮加快，即自噬活性升高。因此，无论是在Western Blot中观测到LC3-II水平发生变化或者是未发生变化，都应该进一步联合自噬后期溶酶体抑制剂来准确判断自噬潮受到的具体影响。

图2 LC3 turnover实验[13]

2.2 GFP的抗降解性用于自噬研究

由于GFP蛋白具有桶状的紧实结构，因此比LC3等蛋白更难被自噬溶酶体降解。因此，人们常常通过检测转染了GFP-LC3的细胞所产生的GFP片段来评判细胞内自噬水平的变化。其原理是因为GFP-LC3的LC3部分会在早期自噬溶酶体中被降解，而GFP却由于抗降解性而暂时保留，因此会产生一些游离的GFP片段。但这些游离的GFP片段会在晚期的自噬溶酶体中被逐渐降解(图3)[21]。

图3 自噬后期溶酶体抑制剂浓度影响GFP-LC3降解(改自[21])

通常情况下，由于细胞的基础自噬水平较低，而溶酶体的降解活性较高，所以能检测到的GFP条带很少。但是当细胞被一些方式处理后，例如加入特定的小分子化合物，有时会发现游离的GFP片段增多，这通常有两种可能：1)自噬的起始阶段被促进，使大量的GFP-LC3参与自噬，而自噬过程中产生的GFP由于较难降解，从而导致GFP片段增多；2)自噬后期的短暂或微弱抑制导致溶酶体中蛋白酶活性部分抑制，从而不能降解结构紧实的GFP，导致GFP积累。一些低浓度自噬后期抑制剂处理，或者是虽然使用了饱和浓度的抑制剂，但是处理时间很短，都会导致此现象的产生(图3)。例如Baf A1，需要30～50 min才能升高溶酶体pH值[35]；而NH4Cl只需要5 min[28, 36]。随着时间的延长，溶酶体活性完全受到抑制，GFP-LC3中的LC3也不再被降解，因此GFP-LC3将作为一个完整蛋白存在，导致游离的GFP片段开始减少(图3)[21]。

除了GFP-LC3外，我们还发现其他通过自噬降解的蛋白也有类似的用途。例如多巴胺受体2和3(DRD2和DRD3)都可以通过自噬途径降解，而GFP标记的DRD2和DRD3所产生的GFP片段不仅像GFP-LC3一样可以反映自噬潮的变化，并且GFP-DRD3看起来是比GFP-LC3更加敏感的自噬潮水平标志物[28, 37]。

2.3 p62作为自噬活性指标

除LC3外，p62也是一个经常被人们使用的自噬标志物。由于p62有结合泛素的结构域，并通过LIR(LC3-interacting region)与LC3-II相互作用[19]，能将泛素化的底物特异性地富集到自噬体降解，同时p62本身也作为自噬底物被降解。因此，如果自噬水平升高，则p62的降解将会加强，从而导致p62水平的降低，这一点经常被人们用作自噬水平升高的辅助检测手段。值得注意的是，如果自噬水平升高不明显，p62的减少可能并不明显，甚至难以检测。相反，如果p62水平增加，说明自噬过程受到抑制。同时需要指出的是，除了参与细胞自噬之外，p62也参与了其他多种细胞活动。例如细胞信号转导、受体内化和蛋白质周转等，因此调控这些途径也会导致p62水平发生变化[38]。此外，p62可能作为mTORC1的组成成分来参与调节细胞对营养状态的应答[39]。因此，在运用p62作为自噬底物这一标准来检测自噬状态时，最好联合其他检测手段进行证实。

2.4 mRFP-GFP-LC3双荧光活细胞成像

除了利用Western Blot来检测GFP片段之外，人们还利用了GFP荧光的pH敏感性，在活细胞成像中使用mRFP/mCherry-GFP-LC3双荧光检验来作为判断自噬潮水平的有力工具。mRFP-GFP-LC3活细胞成像能实时动态监测自噬过程，并能通过颜色变化确定自噬潮水平高低。其原理是GFP绿色荧光在酸性条件下淬灭，因此溶酶体中的GFP-LC3无法显示出绿色[40]。但是红色荧光蛋白RFP或mCherry等在酸性条件下比较稳定，因此可以用mRFP/mCherry-LC3来标记所有的自噬结构。利用荧光蛋白对pH的差异，Tamotsu Yoshimori组构建了串联GFP和mRFP两种荧光分子的LC3载体mRFP-GFP-LC3[16]。正常情况下，由于mRFP可以显示出全部自噬结构，而酸性溶酶体中的GFP荧光淬灭，因此细胞中的红色点数应该超过绿色点数；如果自噬水平升高，则mRFP通道观测到的自噬体增加；如果自噬后期受到抑制，则GFP通道由于溶酶体中的pH值的升高而绿色荧光增加，总体看来呈现黄色增加；如果自噬早期阶段受到抑制，则红色和绿色都降低[16]。因此mRFP/mCherry-GFP-LC3是一个利用活细胞观察自噬水平的强有力工具(图4)。

2.5 电镜用于自噬研究

相对于荧光显微镜，透射电子显微镜分辨率更高，因此电镜也是自噬研究中最经典的方法。然而，电镜的样品制备要求较高，自噬体/自噬溶酶体不易辨认，对实验者的辨别能力要求较高[41]。同时，电镜的结果还需要定量统计，并且为了防止主观影响，推荐进行双盲实验来定量细胞中自噬体或自噬溶酶体数量[42]。因此，尽管电镜是自噬研究的“金标准”，但对实验设备和实验者的技能与辨别能力要求较高，而且无法观察活细胞，因此在很多不具备这些条件的实验室难以实现。

图4 mRFP-GFP-LC3用作活细胞成像

2.6 流式细胞术

目前已经知道细胞在不同周期中的自噬水平有所不同[43-45]。而常规自噬研究手段如Western Blot获得的是整个细胞群体的自噬水平的均值，不能区分各个细胞时相的自噬水平，并且由于LC3分子量较小，LC3-II的结果经常受到转膜效率等的影响而不够准确[12]。免疫荧光联合细胞周期标志物，尽管能区分部分细胞周期时相，但是得到可信的结果需要很多的样本量进行统计，而且无法得到准确的LC3-II荧光强度。而流式细胞术不仅可以检测各个细胞时相的自噬水平，还能直接计算出荧光强度和阳性细胞百分比[46]。但是由于流式细胞术并不能区分LC3-I和LC3-II，因此，细胞在染色之前，需要使用digitonin等去垢剂预处理，以去除胞质中的LC3-I。

3 影响自噬的实验因素

3.1 培养基新鲜程度及血清影响自噬

实验室常用的细胞培养基中含有多种氨基酸，其中L-glutamine在37℃或较高温度长时间放置(例如在水浴锅中预热过长)，会降解产生氨[28, 47]。而氨不仅可以通过影响溶酶体的pH从而对自噬潮有明显的抑制，并且也同时通过抑制mTORC1促进自噬[28]。因此，对于自噬研究而言，培养基本身务必新鲜配制，从而防止较高温度下长时间或不适当存储导致的L-glutamine降解。同时，我们强烈推荐选用本身不含L-glutamine的培养基，在使用前加入L-glutamine，或者用二肽GlutaMAX替换，因为培养基中的GlutaMAX即使处于37℃7 d都稳定存在，并不会降解产生氨(图5)。同时需要注意的是，血清作为培养基中重要的营养物质，对自噬活性也有显著影响，不同公司血清质量差异很大，建议使用同一公司同一货号或批号的血清。

图5 含有谷氨酰胺的培养基降解产生氨[28]

3.2 培养基换液时间对自噬的影响

培养基中很多成分影响自噬水平，而且细胞代谢产物也会影响自噬，因此，需要控制培养基的换液时间，减弱培养基及细胞代谢产物对药物靶点相关信号通路本底产生的影响。如果做RNA干扰实验(一般需要72 h)，建议收取细胞做相关检测前24 h给细胞换新鲜培养基，减弱营养消耗导致的饥饿及产生的代谢物对基础自噬水平的影响。如果需要短时间药物处理细胞(例如加药几分钟或者1～2 h)，建议提前1 d给细胞换液，过夜后直接加药；而不建议换新鲜培养液后较短时间即加药，因为新鲜培养液本身对细胞自噬水平也是一种刺激，会对自噬产生影响。

3.3 实验中的其他注意事项

PVDF膜比NC膜(硝酸纤维素膜)对LC3-II有更高的亲和力，因此，推荐使用PVDF膜检测LC3-II[12]。由于LC3分子量较小(14～16 ku)，推荐用较高浓度的分离胶(15%)来分离LC3-I和LC3-II，用较短的转膜时间(如Bio-Rad湿转，100 V，15～20 min即可，具体根据分离胶浓度做微调)，防止LC3在转膜过程中穿过PVDF膜而丢失。另外，LC3有多种异构体，如LC3A、LC3B和LC3C，其中LC3A主要以I型存在，LC3B是主要的自噬标志物，因此建议选用LC3B抗体。另外，由于所使用的LC3抗体识别位点可能不同，对LC3-I和LC3-II的亲和力不同，得到的结果可能也不同。因此，使用LC3抗体时要查阅抗体说明书，明确抗体对LC3-I和LC3-II的亲和力[12]。不同公司的p62抗体识别的抗原表位也不同[48]，因此，需要根据不同公司的抗体的结果，确定一些现象的正确性。

对于涉及Western Blot检测GFP条带的实验，上样缓冲液要新鲜，保证其中的DTT或β-巯基乙醇充足，而且蛋白样品变性要充分，因为GFP结构紧凑，如果变性不充分，可能导致折叠的GFP蛋白阻滞在浓缩胶中，造成假阴性结果[11]。此外，我们前期发现细胞密度对各种信号通路、LC3-II及p62等都有显著影响。因此，建议控制细胞密度，防止较低或较高的细胞密度本身对自噬的影响，从而提高实验的可重复性。

4 小结

细胞自噬是一个高度动态的过程，因此也需要动态的检测。由于各种自噬研究方法的局限性，人们必须要结合多种不同的实验方法来综合判断细胞自噬水平的变化。仅靠单一的检测LC3-II的水平并不能反映细胞自噬潮水平的真正变化，需要同时结合p62、LC3 turnover实验、电镜以及mRFP/mCherry-GFP-LC3双荧光检验等来综合判断。此外，培养基的成分和储存等也对自噬有着很大的影响。因此人们需要在自噬研究过程中对这些问题都给以足够的重视，从而得到真实可重复的有意义的实验结果。