姜黄素通过抑制心肌组织炎症反应改善自身免疫性心肌炎大鼠的心功能

王丽君,霍建华,张卫萍,张 勇,王 晨,周 娟,袁祖贻,郜珊珊*

(1西安交通大学第一附属医院心内科,西安 710061;2陕西省分子心脏病学重点实验室;3环境与疾病相关教育部重点实验室;*通讯作者,E-mail:gaoshanshj@163.com)

实验性自身免疫性心肌炎(experimental autoimmune myocarditis,EAM)，简称自身免疫性心肌炎，是一种炎症免疫性疾病,主要由T细胞介导,在疾病的进展过程中,其释放的多种炎性物质吸引巨噬细胞、肥大细胞等多种炎性细胞及其分泌的炎症细胞因子参与[1,2]。EAM可由感染性或非感染性因素导致,感染性因素最常见的是病毒感染,如柯萨奇病毒、巨细胞病毒、流感病毒等。病毒导致心肌炎的主要机制包括:病毒对心肌的直接毒性作用;病毒激活体内的T淋巴细胞,由其介导并导致心肌细胞中大量炎性细胞浸润;病毒诱导心肌细胞发生凋亡[3,4]。

姜黄素是中国传统中药姜黄的主要活性成分,具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗凝、降血脂、改善胰岛素抵抗等多种药理学作用[5]。研究发现,姜黄素能够改善心力衰竭大鼠以及兔的心功能状态[6,7],另外有研究表明,姜黄素能够减轻心肌梗死大鼠模型心肌缺血再灌注损伤[8],而姜黄素是否能够改善自身免疫性心肌炎大鼠心功能,且该作用是否与姜黄素的抑制炎症作用有关,目前尚未完全研究清楚,因此本研究采用大鼠后足垫注射猪心肌免疫球蛋白建立自身免疫性心肌炎大鼠模型,观察姜黄素干预是否能够抑制心肌组织炎症反应从而延缓自身免疫性心肌炎大鼠心脏结构变化,并改善其心功能。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂

6周龄SPF级雄性Lewis大鼠18只,体质量230-280 g,购自北京维通利华实验动物有限公司(生产许可证号:SCXK(京)2016-0011)。姜黄素、猪心肌肌球蛋白、弗氏完全佐剂、DAPI均购自美国Sigma公司;玉米油购自中国长寿花食品股份有限公司;伊红、苏木素购自美国Amresco公司;OCT包埋剂购自上海Leica有限公司。

免疫大鼠所用抗原佐剂乳化液由猪心肌肌球蛋白和弗氏完全佐剂乳化后获得。制备方法为:两个注射器分别吸取等量猪心肌肌球蛋白和弗氏完全佐剂(含有1 mg/ml的结核分枝杆菌),连接到三通管其中的两头上,两个注射器不断配合对推,每次对推3 min,对推8-10次后检查是否达到完全乳化，完全乳化的猪心肌肌球蛋白呈乳白色,将其滴入水平面后不会扩散,若乳化不完全则继续对推直至完全乳化。整个操作过程在冰上进行,乳化液在1 h内完成注射。

1.2 自身免疫性心肌炎大鼠模型的建立

18只大鼠随机分为对照组(Con组),模型组(EAM组)及姜黄素处理组(Cur组),每组6只。对照组(Con组):实验第0天和第7天,后足垫皮下注射弗氏完全佐剂(左右后足垫各0.1 ml),同时每天以玉米油灌胃;模型组(EAM组):实验第0天和第7天,后足垫皮下注射抗原佐剂乳化液(左右后足垫各0.1 ml),每天以玉米油灌胃;姜黄素处理组(Cur组):实验第0天和第7天,后足垫皮下注射抗原佐剂乳化液(左右后足垫各0.1 ml),每天给予姜黄素[50 mg/(kg·d)]灌胃,共21 d。大鼠饲养在西安交通大学医学部动物实验中心SPF级实验动物房,自由饮水、自由摄食,普通SPF级无菌饲料喂养直至实验结束。

1.3 心动超声检测大鼠心脏结构与功能

姜黄素干预21 d,实验第22天,腹腔注射90 mg/kg氯胺酮和10 mg/kg甲苯噻嗪的混合溶液麻醉大鼠,心动超声检查大鼠心脏结构和功能的变化,测量内容包括:心率(heart rat,HR),左室收缩末内径(left ventricular end-systolic diameter,LVEDs),左室短轴缩短率(left ventricular fractional shortening,LVFS),射血分数(ejection fraction,EF),左室后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness,LVPW),左室舒张末内径(left ventricular end-diastolic diameter,LVEDd)。由一位经验丰富超声专业医生测定心动超声指标,各项测量值均取5个连续心动周期采样获得的平均值。

1.4 实时定量PCR(RT-PCR)检测心肌炎症相关指标IL-1β、iNOS、MMR、KLF-4、Arg-1的表达

取大鼠心肌组织,提取RNA并按照逆转录试剂盒(Fermentas)将RNA逆转录为cDNA。以GUSB为内参,行RT-PCR检测各因子表达。核酸引物序列由上海捷瑞基因公司合成(见表1)。

表1 炎症相关因子RT-PCR核酸引物序列Table 1 Primer sequences of inflammation-related factors for real-time PCR

1.5 苏木素-伊红染色(HE染色)观察大鼠心肌炎症细胞浸润程度并计算HE染色病理评分

取大鼠整个心脏,生理盐水冲洗,4%多聚甲醛固定,25%蔗糖溶液中脱水,待脱水完全,滤纸吸干水分,OCT复合物包埋,冰冻切片。从心尖部开始向心底部连续横切,切片厚度为8 μm。HE染色,200倍和400倍荧光显微镜扫描,随机观察3个不重叠病变区域,并对病变区域进行评分:0分,正常心肌组织;2分,心肌组织有病变,且病变区域超过横切面的1%但小于10%;3分,心肌组织有病变,且病变区域超过横切面的10%但小于50%;4分,心肌组织病变超过横切面的50%。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 姜黄素对EAM大鼠心率的影响

实验第22天,麻醉大鼠后行心动超声检查,EAM组大鼠心率较Con组大鼠明显增快(445.5±8.00vs564±10.93,P<0.01),提示大鼠心功能恶化。给予50 mg/(kg·d)姜黄素灌胃后,Cur组大鼠较EAM组大鼠心率明显下降(564±10.93vs479.7±11.56,P<0.01),提示大鼠心功能改善。

数值以均数±标准误表示;与Con组比较,**P<0.01;与EAM组比较,##P<0.01图1 姜黄素对EAM大鼠心率的影响Figure 1 Effect of curcumin on the heart rate of EAM rats

2.2 姜黄素对EAM大鼠左室结构及功能的影响

超声心动图的结果显示,与Con组相比,EAM组大鼠LVEDd和LVPW无显著变化,但LVFS和EF显著降低,LVEDs显著增加,这表明心肌炎大鼠出现左心室收缩功能障碍。Cur组大鼠LVFS和EF较EAM组大鼠明显改善,LVEDs明显缩小,差异具有统计学意义(P<0.01),表明姜黄素能够改善心肌炎引起的左心室收缩功能障碍。

表2 大鼠心脏超声结果及血液动力学改变Table 2 Echocardiographic and hemodynamic parameters of the

EF:射血分数;LVEDs:左室收缩末内径;LVEDd:左室舒张末内径;LVFS:左室短轴缩短率;LVPW:左室后壁厚度;与Con组比较,**P<0.01;与EAM组比较,##P<0.01

2.3 姜黄素对EAM大鼠心肌细胞炎症因子表达的影响

炎性细胞因子IL-1β和iNOS表达的水平能够反映细胞或组织炎性状态。RT-PCR结果显示,EAM组大鼠心肌细胞中IL-1β和iNOS表达显著升高,提示心肌炎大鼠心肌细胞内的高炎症状态。给予姜黄素干预后,二者表达明显降低(P<0.01)。与对照组相比,Cur组大鼠心肌组织炎性因子的表达差异并无统计学意义。

2.4 姜黄素对EAM大鼠心肌细胞抗炎因子表达的影响

RT-PCR结果显示:EAM组大鼠心肌细胞内MMR、Arg-1及KLF-4的表达均较Con组降低降低,且差异有统计学意义(P<0.05)。给予姜黄素干预21 d,Cur组大鼠心肌组织MMR和Arg-1的表达较Con组及EAM组明显升高(P<0.01)。Cur组大鼠KLF-4表达与Con组差异并无统计学意义(P>0.05);与EAM组大鼠相比,其表达明显升高(P<0.05,见图3)。

2.5 姜黄素对EAM大鼠心肌炎症细胞浸润程度的影响

HE染色显示,Con组大鼠心肌组织中炎性细胞浸润较少;EAM组大鼠心肌中有大量炎性细胞浸润。姜黄素干预后,Cur组大鼠心肌组织中炎性细胞浸润明显减少(见图4)。与Con组相比,EAM组HE染色病理评分升高(0.57±0.34vs5±1.0,P<0.01)。虽然与Con组相比,Cur组HE染色的病理评分仍有增加(0.57±0.34vs1.36±0.56,P<0.05),但与EAM组相比,Cur组大鼠心肌组织HE染色的病理评分明显降低(5±1.0vs1.36±0.56,P<0.01),提示姜黄素可显著减少心肌炎大鼠心肌组织炎性细胞的浸润。

数值以均数±标准误表示;与Con组比较,**P<0.01;与EAM组比较,##P<0.01图2 RT-PCR检测姜黄素对EAM大鼠心肌细胞炎症因子表达的影响Figure 2 Effect of curcumin on expression of inflammatory factors in myocardium of EAM rat by RT-PCRs

数值以均数±标准误表示;与Con组比较,*P<0.05,**P<0.01;与EAM组比较,#P<0.05,##P<0.01图3 RT-PCR检测姜黄素对EAM大鼠心肌细胞抗炎因子表达的影响Figure 3 Effect of curcumin on expression of anti-inflammatory factors in myocardium of EAM rats by RT-PCR

A. Con组 B. EAM组 C. Cur组图4 姜黄素对EAM大鼠心肌炎症细胞浸润程度的影响 (×200)Figure 4 Effect of curcumin on infiltration of inflammatory cells in EAM rats (×200)

3 讨论

本实验采用经典的心肌炎造模方法,使用纯化的猪心肌免疫球蛋白,利用其高度的种属特异性,触发机体免疫反应,诱导自身免疫的发生,最终导致心肌损害。对心肌炎造模后大鼠行心动超声检查,可见大鼠HR加快,EF值下降,LVEDs明显升高,大鼠心功能恶化,提示造模成功。

姜黄素能够抑制心肌纤维化,改善左室重构的作用已在多项研究中证实,涉及的机制也是多方面的。Morimoto等[9]分别以盐敏感高血压大鼠心衰模型和大鼠心肌梗死后心衰模型为研究对象,给予姜黄素干预后,结果提示姜黄素能够降低大鼠B型尿钠肽(brain natriuretic peptide,BNP)表达、显著改善大鼠心室壁厚度、延缓左室收缩功能障碍;体外研究证实,姜黄素发挥上述作用主要是通过破坏p300/GATA4复合物的形成而实现的,而后者正是心肌肥厚及左心室重塑过程中的关键复合物。另外一组研究者[10]在姜黄素作用于小鼠的心衰模型中观察到类似的机制。Guo等[11]通过实验证实姜黄素通过抑制TGF-β1产生和经典Smad信号传导,并通过阻断AMPK/p38MAPK途径,抑制糖尿病大鼠心肌组织中Ⅰ型与Ⅲ型胶原合成,从而改善大鼠心功能。

IL-1β及iNOS是经典的炎症因子,二者在心肌炎大鼠心肌组织内表达显著升高,提示大鼠体内的高炎性状态。给予姜黄素灌胃处理后,IL-1β和iNOS的表达显著下降,Sharma等[12]在帕金森大鼠模型中也观察到姜黄素抑制炎症因子IL-1β和iNOS表达的作用。MMR、Arg-1、KLF-4是具有抑制炎症、调节免疫、促进组织重塑与修复作用的细胞因子,能够拮抗促炎因子的作用[13]。本研究观察到姜黄素能够显著促进上述抗炎因子的表达,提示组织细胞内炎症状态的改善。HE染色同样证实:心肌炎大鼠心肌组织中炎性细胞浸润较对照组明显增加,姜黄素能够显著减少心肌组织内浸润的炎性细胞数量。

iNOS和Arg-1功能完全相反的精氨酸代谢酶类。iNOS作用L-精氨酸产生NO;Arg-1与iNOS竞争性作用底物L-精氨酸,催化L-精氨酸转化为脯氨酸和多胺,并抑制iNOS介导的细胞毒性作用及氧化应激反应造成的细胞损伤。心动超声结果显示姜黄素干预后EAM大鼠左室收缩末内径明显减小,而舒张末内径并无明显变化,提示姜黄素主要改善心肌炎大鼠的心脏收缩功能,对其舒张功能的改善并不明显。这有可能是因为Arg-1促进L-精氨酸转化为脯氨酸,后者能够参与到胶原形成过程中并导致纤维化[14]。该结果提示长期及高剂量姜黄素的临床应用应该尤其注意其因为促进心肌纤维化带来的副作用。

综上所述,本研究以自身免疫性心肌炎大鼠为研究对象,给予姜黄素灌胃处理,研究结果提示姜黄素能够通过减少EAM大鼠心肌炎症因子表达、促进抗炎因子表达、减少EAM心肌炎症细胞的浸润从而减慢EAM大鼠心率、增加心脏射血分数、改善其心脏收缩功能。目前心肌炎尚无特效治疗方法,本实验观察到姜黄素对心肌炎的改善作用,为心肌炎的临床治疗提供了新的思路。