不同剂量中波紫外线对原代角质形成细胞增殖和自噬的影响

宋健文,黄惠梅,张 英,王 博

(1西安市儿童医院皮肤科,西安 710003;2西安市儿童医院肾脏科;3西安交通大学第一附属医院消化内科;4西安交通大学第一附属医院转化医学中心;5陕西省肿瘤精准医学重点实验室;*通讯作者,E-mail:realwbo@163.com)

自噬是真核细胞中广泛存在的自我保护机制,主要功能是降解蛋白质和细胞器以及保持细胞内环境稳定性以适应细胞外各种环境压力和刺激,故自噬也是细胞自我更新的基本途径[1]。虽然自噬是细胞内基本的生理现象,但已有的研究充分表明,自噬在炎症反应中发挥着重要的作用,特别是过度的自噬反应可能诱导炎性疾病的发生发展,例如感染性疾病,代谢性疾病和自身免疫性疾病等[2,3]。因此,研究自噬在疾病发生发展的机制,有利于疾病发病机制研究以及为临床治疗靶点的筛查提供新思路。

目前,紫外线过度照射对皮肤造成的损伤也越来越受到人们的重视。紫外线过度照射的损伤对象包括皮肤的各个组成部分,其中中波紫外线(ultravio-let B,UVB)主要作用的靶部位是角质形成细胞(keratinocyte)。UVB可能是通过DNA损伤、部分信号通路的异常以及炎症反应的产生等形式对皮肤造成损伤[4-6]。UVB可诱导角质形成细胞产生一系列炎症细胞因子,通过炎症细胞因子UVB可参与皮肤内环境细胞损伤、修复、增殖和凋亡等过程[7,8]。而UVB诱导炎症反应的过度激活,可能通过自噬反应发挥作用,故本研究通过不同剂量UVB照射原代角质形成细胞,检测UVB对角质形成细胞增殖和自噬的影响,再通过自噬抑制剂和促进剂处理细胞观测UVB照射角质形成细胞后对其存活率的影响,最终确定不同剂量中波紫外线对原代角质形成细胞增殖和自噬的影响。

1 材料和方法

1.1 主要试剂及仪器

RPMI 1640培养基购自美国Hyclone公司;小牛血清购自中国四季青公司;0.25%胰酶,限制性KC-FSM培养基购自美国Gibico公司;dispase酶,雷帕霉素,氯喹购自美国Sigma-Aldrich公司;兔抗人LC3和GAPDH多克隆抗体购自英国Abcam公司;HRP标记羊抗兔Ig G抗体购自北京博奥森生物技术有限公司;ECL试剂盒购自美国Pierce公司;SUV-1000日光紫外线模拟器购自中国上海希格玛高技术有限公司。

1.2 原代细胞株及主要试剂

取新切除的包皮组织，用含有青霉素100 U/ml和链霉素100 U/ml的PBS清洗3次，剪除皮下脂肪组织，并将皮肤组织剪成0.5 cm×0.5 cm大小的组织块，用0.5% dispase酶在4 ℃消化过夜；分离表皮和真皮，表皮中加入0.25%胰酶(含0.2% EDTA)置于37 ℃中消化10 min，用含10%小牛血清的RPMI 1640培养基终止胰酶消化；200目滤网过滤细胞，2 000 r/min离心获取细胞沉淀，用限制性KC-FSM培养基置于37 ℃，5% CO2培养。人皮肤原代角质形成细胞培养至少3代后用于实验。

1.3 UVB照射细胞

按照5.0×105个细胞/孔的密度将人皮肤原代角质形成细胞接种于6孔板。当细胞密度达到80%-90%时,用日光紫外线模拟器进行UVB照射;每个孔照射时周围用遮光纸完全遮盖,对于UVB照射剂量共设4组:对照组(0 mJ/cm2),10 mJ/cm2,20 mJ/cm2和40 mJ/cm2组。UVB照射细胞后,根据实验时间点收集细胞用于后续实验或直接用于下步检测。

1.4 MTT法检测细胞活力

不同剂量UVB照射细胞后12 h,每孔加入5 g/L的四甲基偶氮唑蓝(MTT)100 μl,混匀后将细胞置于37 ℃培养箱避光孵育4 h。取出培养板将上清弃掉，加入2 ml的二甲基亚砜(DMSO)，室温混匀10 min，待结晶全部溶解后通过全波长酶标仪在波长为490 nm处检测各孔的A值(A值越高代表细胞活力越高)。

1.5 MDC染色法检测细胞自噬表达阳性率

不同剂量UVB照射细胞后12 h,弃掉培养基,PBS漂洗1次,每孔加入50 μmol/L的单丹磺酰戊二胺(dansylcadaverine,MDC)200 μl,室温避光孵育40 min,PBS漂洗3次,置于倒置荧光显微镜下于激发波长355 nm处观察细胞自噬情况。绿色荧光代表自噬的发生,在倒置荧光显微镜下观察到细胞质内出现3处以上高密度绿色荧光点,即判定为MDC染色阳性细胞。每个孔随机选取5个视野,计数每个视野中总细胞数和MDC染色阳性细胞数,计算出细胞自噬表达阳性率。

1.6 氯喹和雷帕霉素预处理方法

按照1.3 UVB照射细胞实验方法,将实验分为对照组,氯喹处理组和雷帕霉素处理组。当细胞贴壁后,氯喹处理组给予1 μmol/L的氯喹处理,雷帕霉素处理组给予20 μmol/L的雷帕霉素处理,继续培养24 h后,弃去培养基,PBS漂洗2次,随后对细胞进行20 mJ/cm2的UVB照射,照射2 h MTT检测细胞活力。

1.7 自噬相关蛋白的检测

用含有蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液(RIPA)在冰上裂解细胞提取蛋白。用BCA试剂盒定量提取蛋白质含量,并按照40 μg总蛋白上样量SDS-PAGE分离蛋白。在12%分离胶中电泳后,将蛋白质从分离胶中转移到PVDF膜上,用5%的脱脂奶粉对膜室温封闭2 h。1 ∶1 000稀释抗LC3和GAPDH抗体作为一抗,4 ℃孵育过夜。TBST漂洗,用1 ∶5 000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体作为二抗,室温孵育2 h。TBST漂洗,滴加ECL化学发光液进行发光,成像系统成像。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 不同剂量UVB照射对角质形成细胞增殖的影响

为检测UVB对角质形成细胞增殖的影响,选择人皮肤原代角质形成细胞在接受不同剂量(0,10,20,40 mJ/cm2)UVB照射后12 h运用MTT法检测细胞增殖活力。结果表明,随着UVB照射剂量的增加,角质形成细胞的透明度明显增加,细胞间隙明显变宽,部分贴壁细胞失去正常贴壁形态变成圆形,同时漂浮的凋亡细胞数目显著增加。MTT实验结果显示,随着UVB照射剂量的增加,角质形成细胞的增殖活力具有降低趋势(F=51.079,P<0.001),其中以0 mJ/cm2作为对照组,其余各组与对照组相比,细胞活力显著下降,差异有统计学意义(P<0.01,见表1)。

表1 不同剂量UVB照射对角质形成细胞活力的作用Table 1 Keratinocyte viability after irradiation with different doses of

与对照组(0 mJ/cm2)比较,**P<0.01,***P<0.001

2.2 不同剂量UVB照射对角质形成细胞自噬表达阳性率的影响

同样对人皮肤原代角质形成细胞进行不同剂量UVB照射后,MDC染色法检测角质形成细胞自噬表达阳性率。结果表明,随着UVB照射剂量的增加,角质形成细胞自噬表达阳性率显著增加(F=2 148.2,P<0.001),其中以0 mJ/cm2作为对照组,其余各组与对照组相比,细胞自噬表达阳性率显著增加,但40 mJ/cm2组细胞自噬表达阳性率出现一定抑制,差异有统计学意义(P<0.001,见表2)。

表2 不同剂量UVB照射对角质形成细胞自噬表达阳性率的作用Table 2 Proportion of autophagosome-positive cells under different doses of UVB

与对照组(0 mJ/cm2)比较,***P<0.001

2.3 不同剂量UVB照射对角质形成细胞自噬相关蛋白表达的影响

人皮肤原代角质形成细胞经0,10,20,40 mJ/cm2UVB照射后,通过Western blot技术检测自噬相关蛋白LC3的表达水平。结果表明,随着UVB照射剂量的增加,角质形成细胞自噬相关蛋白LC3-Ⅱ表达水平逐渐升高，其中20 mJ/cm2和40 mJ/cm2组显著增加(见图1)。该部分结果说明不同剂量UVB照射可使角质形成细胞自噬水平明显升高，其中20 mJ/cm2的UVB照射是自噬水平明显增加的最低照射剂量，可选作后续实验的照射剂量。

图1 不同剂量UVB照射对人皮肤原代角质形成细胞自噬相关蛋白表达的影响Figure 1 Expression of autophagy-related proteins in human primary keratinocytes after exposed to different doses of UVB by Western blot

2.4 UVB照射后不同时间点对角质形成细胞自噬相关蛋白表达的影响

选择20 mJ/cm2UVB照射人皮肤原代角质形成细胞后,在0 h,2 h,4 h和8 h不同时间点通过Western blot技术检测自噬相关蛋白LC3的表达水平。结果显示,20 mJ/cm2UVB照射角质形成细胞后,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ表达水平先升高后降低，其中照射后2 h LC3-Ⅱ表达水平最高，随后4-8 h逐渐降低(见图2)。结果说明20 mJ/cm2UVB照射角质形成细胞后2 h，细胞自噬达到相对较高的水平。

图2 UVB照射后不同时间点对人皮肤原代角质形成细胞自噬相关蛋白表达的影响Figure 2 Expression of autophagy-related proteins in human primary keratinocytes at different time points after UVB irradiation by Western blot

2.5 促进或抑制自噬对UVB照射角质形成细胞存活率的影响

将人皮肤原代角质形成细胞分别使用自噬抑制剂氯喹(chloroquine,CQ)和自噬促进剂雷帕霉素(rapamycin,RAPA)进行预处理,再对细胞进行20 mJ/cm2的UVB照射后2 h采用MTT实验检测细胞活力。结果表明,预先使用CQ和RAPA处理的人皮肤原代角质形成细胞后,照射2 h检测细胞活力的A490值分别为：对照组0.895±0.022,氯喹处理组0.396±0.050,雷帕霉素处理组0.957±0.048。与对照组相比,雷帕霉素处理组细胞存活率具有增高的趋势,而氯喹处理组细胞存活率显著降低,差异有统计学意义(P<0.001,见图3)。结果说明雷帕霉素有提高UVB照射后角质形成细胞存活率的趋势,而氯喹可显著降低UVB照射后角质形成细胞的存活率。

与对照组相比较,***P<0.001图3 氯喹和雷帕霉素对UVB照射后人皮肤原代角质形成细胞存活率的影响Figure 3 Effect of chloroquine and rapamycin on the viability of human primary keratinocytes after UVB irradiation

3 讨论

自噬是真核细胞自我吞噬的现象,是细胞通过溶酶体降解细胞内被损伤或是老化的蛋白和各种细胞器并再利用的过程,是细胞维持自身稳定并完成自我更新的重要防御机制[10]。自噬过程是一个高度保守的生物学过程,前期主要是细胞在氧化应激或饥饿等条件刺激下,内质网和高尔基体脱落的磷脂双分子层膜通过延伸,将细胞内损伤或老化的细胞器和生物大分子吞噬包裹形成自噬小体;自噬小体通过细胞骨架微管系统运输,再与溶酶体进行融合形成自噬溶酶体;由溶酶体中的各种相关酶将细胞器和生物大分子完成降解过程,并为机体产生能量,同时自噬小体也可以通过再回收和再利用的生物学过程来维持细胞内环境的稳定[11,12]。有多种细胞内信号通路以及自噬相关蛋白参与自噬的发生,例如自噬上游信号通路哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR),磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase)以及蛋白激酶B(protein kinase B,PKB),即PI3K-Akt-mTOR信号通路,同时还有自噬相关蛋白(autophage-related protein,Atg)家族分子以及微管相关蛋白轻链3(light chain 3,LC3),其中LC3-Ⅱ是由LC3-Ⅰ剪切而来,是自噬体形成的标志性分子,被广泛用于检测和定量评定细胞自噬的活性[13,14]。大量的研究表明,自噬在多种疾病中表现出异常的表达水平,且自噬相关基因的突变与感染,神经退行性疾病以及肿瘤密切相关[15]。

紫外线过度照射是人类皮肤损伤的重要因素之一。紫外线特别是中波紫外线,是外界环境中导致皮肤损伤和病理变化的主要因素。而角质形成细胞是皮肤中最为重要的一类细胞,UVB可通过DNA损伤、氧化应激和免疫抑制等对角质形成细胞造成损伤。所以深入研究UVB对角质形成细胞损伤的机制对相关皮肤病的预防和治疗具有重要的意义和价值。目前,自噬在各种皮肤病中的作用机制研究日益受到皮肤学界学者的关注,特别是在黑色素瘤中自噬水平显著高于良性的黑色素痣[16];也有研究在黑色素瘤中,自噬相关蛋白Bcelin 1表达的下调和疾病的进展呈正相关[17];黑色素瘤组织中自噬的水平与转移性黑色素瘤患者低生存率密切相关,抑制自噬可使侵袭性黑色素瘤细胞凋亡[18]。国内也有报道,UVB对HaCaT细胞增殖活力的损伤有剂量依赖性,而原代角质形成细胞更耐受UVB损伤[19]。同时,目前已有大量文章对UVB诱导细胞凋亡进行了细致的研究,但自噬与UVB照射的机制研究相对较少[20,21]。如上所述,初步研究不同剂量UVB对原代角质形成细胞自噬的影响,可以为自噬在UVB光损伤疾病中机制研究提供基础,也为临床预防和治疗提供新的理论依据。

本研究分离了人皮肤角质形成细胞,检测了不同剂量UVB照射细胞后其增殖活力、细胞自噬表达阳性率和自噬相关蛋白的表达水平,而且观察提前干预自噬检测UVB对细胞存活率的影响，结果表明,原代角质形成细胞经10,20,40 mJ/cm2UVB照射后,细胞增殖活力显著下降,自噬表达阳性率显著增加且自噬相关蛋白LC3-Ⅱ表达水平逐渐升高;20 mJ/cm2UVB照射角质形成细胞2 h时LC3-Ⅱ表达水平最高,而4 h和8 h呈逐渐降低趋势;使用自噬促进剂雷帕霉素预处理角质形成细胞有提高UVB照射后细胞存活率的趋势,而自噬抑制剂氯喹可显著降低UVB照射后细胞的存活率。本结果说明UVB照射可以对原代角质形成细胞起到抑制细胞增殖和促进自噬发生的作用,且抑制自噬可显著降低UVB照射后细胞的存活率。本研究结果为深入研究UVB照射对原代角质形成细胞增殖和自噬的影响提供了具体细胞实验的照射条件以及了解UVB与自噬的分子机制提供了新的出发点,但促进自噬是否可以部分缓解UVB照射对细胞的影响,以及自噬在其中发挥作用的具体分子机制,仍需要进一步的深入研究。