miR—221对结核分枝杆菌感染巨噬细胞后炎性因子表达的影响

2018-09-17 02:51何宝明柏莹李艳琴
中国医药导报 2018年24期
关键词:物组报告基因荧光素酶

何宝明 柏莹 李艳琴

[摘要] 目的 探讨microRNA-221(miR-221)对结核分枝杆菌感染巨噬细胞后炎症因子水平的影响。 方法 用qRT-PCR检测结核分枝杆菌感染后巨噬细胞中miR-221的表达;用miR-221模拟物和miR-221抑制物转染结核分枝杆菌感染的巨噬细胞,采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法和Griess法分别检测炎症因子表达和NO分泌;双荧光素酶报告基因、qRT-PCR和Western blot法检测miR-221和Rho相关蛋白激酶1(ROCK1)的靶向关系。 结果 miR-221在结核分枝杆菌感染的巨噬细胞中低表达;miR-221模拟物上调巨噬细胞miR-221的表达水平,抑制巨噬细胞肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6和NO的分泌;miR-221抑制物下调巨噬细胞miR-221的表达水平,促进巨噬细胞TNF-α、IL-1β、IL-6和NO的分泌;miR-221可作用于ROCK1的3′UTR,并抑制其表达(P < 0.05)。 结论 miR-221通过靶向抑制ROCK1的表达抑制结核分枝杆菌感染巨噬细胞后的炎症因子的表达。

[关键词] 结核分枝杆菌;单核巨噬细胞;MicroRNA-221;Rho相关蛋白激酶1;炎症因子

[中图分类号] R521 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210(2018)08(c)-0014-05

[Abstract] Objective To explore the effects of miR-221 on the inflammatory factor secretion from macrophages after Mycobacterium tuberculosis infection. Methods The expression of miR-221 in macrophages after Mycobacterium tuberculosis infection was detected by real-time quantitative PCR (qRT-PCR). Macrophages were transiently transfected with miR-221 mimic or miR-221 inhibitor. The expression of macrophage inflammatory factor and secretion of NO were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and Griess method, respectively. The relationship of miR-221 and Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase 1 (ROCK1) was analyzed by dual-luciferase reporter gene assay, qRT-PCR and Western blot. Results Down-regulated miR-221 was observed in macrophages infected with Mycobacterium tuberculosis. The expression of miR-221 in macrophages was up-regulated by miR-221 mimics, but down-regulated by miR-221 inhibitors. The secretions of TNF-α, IL-1β, IL-6 and NO were significantly accelerated in macrophages infected with Mycobacterium tuberculosis, and increased in miR-221 up-regulated macrophages, but suppressed in miR-221 down-regulated macrophages. miR-221 directly binds to the 3′UTR of ROCK1, and negatively regulated its expression. Conclusion miR-221 can regulate the ROCK1 expression and inhibit the secration of inflammatory factors expression in macrophages after Mycobacterium tuberculosis infection.

[Key words] Mycobacterium tuberculosis; Monocyte-derived macrophages; MicroRNA-221; Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase 1; Inflammatory factors

肺結核是由结核分枝杆菌感染引发的一种慢性传染性疾病[1]。巨噬细胞在肺结核的发病机制中发挥重要作用[2]。结核分枝杆菌感染人体后,主要被巨噬细胞吞噬,随后巨噬细胞产生和分泌肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β和IL-6等多种细胞因子介导机体的杀菌过程[3]。同时,感染细菌的巨噬细胞内一氧化氮合酶(NOS)的活性随时间的延长升高,导致NOS的催化底物NO的的含量增加,此NO会作为强抗炎氧化剂促进杀灭结核分枝杆菌[3]。因此,炎症因子和NO在肺结核的疾病进程中起重要作用。研究发现miR-221能够通过调节各类炎症因子的表达,在免疫反应过程中发挥重要作用[4-5]。据报道,microRNA-221(miR-221)在结核分枝杆菌感染的肺结核患者中表达降低[6-7]。本研究探讨miR-221在巨噬细胞抗结核分枝杆菌感染的免疫调节中的作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

结核分枝杆菌强毒株H37Rv(美国ATCC公司);HEK293细胞(中国科学院上海细胞库);miR-221模拟物、抑制物(上海吉玛生物制药技术有限公司);酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(上海BlueGene公司)。

1.2 细菌制备

细菌初次传代后培养6~7 d[8],收集菌液,制成单细菌悬液,再调整浓度至4×107个/mL。

1.3 细胞分离和培养

巨噬细胞分离自健康人的外周血(陕西省汉中市中心医院检验科采集),方法如文献[9]所述。取健康人的静脉血,将血液离心得到单核细胞。洗涤去除血小板后,用含20%人血清白蛋白的RPMI 1640培养基于37℃、5%CO2的培养箱中培养,2~3 d换1次液,7~10 d后即可自然分化成巨噬细胞。

1.4 细胞转染

取对数生长期的巨噬细胞,用LipofectamineTM 2000转染miR-221模拟物、miR-221抑制物以及相应的阴性对照,培养48 h。

1.5 细菌感染巨噬细胞

巨噬细胞与结核分枝杆菌的比例为1∶5,在含0.4%人血清白蛋白RPMI 1640培养基中混合[6],37℃孵育24、48、72 h后收集细胞。

1.6 ELISA检测

收集细胞培养上清,用ELISA法分别检测IL-1β、IL-6和TNF-α的含量。实验重复3次。

1.7 Griess法

收集培养上清液,加Griess试剂反应10 min,检测吸光度(OD550 nm)值,计算NO浓度,实验重复3次。

1.8 双荧光素酶报告基因

双荧光素酶报告基因载体的构建:对ROCK1的3′UTR序列与miR-221相互作用进行预测,且对相互作用的靶点进行序列突变(Mut ROCK1),并将突变序列插入到pGL3荧光素酶报告载体的XbaI/FseI位点。PCR扩增ROCK1包含miR-221假定结合位点的3'UTR cDNA,并将扩增出的序列连接于pGL3双荧光素酶报告基因载体上。将HEK293细胞种于24孔板中,将pGL3-ROCK1 3′-UTR与miR-221模拟物共转染于细胞中。转染48 h后收集细胞,在酶标仪上检测荧光素酶活性,实验重复3次。

1.9 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)

用TRIzol提取细胞总RNA。miR-221的检测:100 ng总RNA用逆转录试剂盒逆转录得到cDNA,以U6为内参基因,用qRT-PCR试剂盒检测miR-221表达水平。ROCK1的检测:2 μg RNA用M-MLV逆转录酶合成cDNA,以β-actin为内参基因,qRT-PCR试剂盒检测ROCK1表达水平。用2-ΔΔCt计算mRNA表达量。

1.10 Western blot

細胞经RIPA裂解后,用BCA法测蛋白浓度,等量蛋白样本上样,经SDS-PAGE分离后转至PVDF膜,50 g/L脱脂奶粉封闭2 h后,加兔抗人ROCK1抗体,4℃孵育过夜;用TBST洗膜后,加入HRP标记的山羊抗兔IgG,室温孵育1 h,洗膜后,ECL化学发光显色,实验重复3次。

1.11 统计学方法

数据采用SPSS 22.0软件进行分析。计量资料以均数±标准差(x±s)表示,组间比较采用t检验或方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结核分枝杆菌感染降低巨噬细胞miR-221的表达

在结核分枝杆菌感染巨噬细胞不同时间后,miR-221的表达水平均显著降低,差异有统计学意义(P < 0.05)。见图1。

2.2 miR-221模拟物和miR-221抑制物改变巨噬细胞miR-221的表达水平

将miR-221模拟物或miR-221抑制物转染入巨噬细胞中,结果发现,miR-221模拟物组的miR-211表达高于模拟物对照组,同时miR-221抑制物组的miR-211表达低于抑制物对照组,差异有统计学意义(P < 0.05)。见图2。

2.3 miR-221抑制结核分枝杆菌感染后巨噬细胞炎症因子的分泌

感染组、模拟物对照组、抑制物对照组巨噬细胞TNF-α、IL-1、IL-6的表达高于对照组,miR-221模拟物组的TNF-α、IL-1、IL-6表达低于模拟物对照组,miR-221抑制物组的TNF-α、IL-1、IL-6表达高于抑制物对照组,差异有统计学意义(P < 0.05)。见图3。

2.4 miR-221抑制结核分枝杆菌感染后巨噬细胞NO的释放

感染组、模拟物对照组、抑制物对照组的NO释放量高于对照组,miR-221模拟物组的NO量高于模拟物对照组,miR-221抑制物组的NO量低于抑制物对照组,差异有统计学意义(P < 0.05)。见图4。

2.5 miR-221对ROCK1的调控作用

用靶基因预测软件(TargetScan)发现,在多种炎症疾病中起重要作用的分子ROCK1是miR-221的一个靶基因(图5A)。双荧光素酶报告结果显示,过表达miR-221,靶基因ROCK1 3′UTR区活性明显受到抑制(P < 0.05,图5B)。检测miR-221对结核分枝杆菌感染细胞中ROCK1表达的影响,感染组、模拟物对照组、抑制物对照组中ROCK1 mRNA和蛋白的表达高于对照组,miR-221模拟物组中ROCK1 mRNA和蛋白的表达低于模拟物对照组,miR-221抑制物组中ROCK1 mRNA和蛋白的表达高于抑制物对照组,差异有统计学意义(P < 0.05,图5C~D)。

3 討论

巨噬细胞是结核分枝杆菌感染的主要靶细胞和宿主细胞,该细胞在结核分枝杆菌引起的免疫反应中起重要作用[10]。机体感染结核杆菌后,巨噬细胞被激活,高表达NOS和L-精氨酸,并在四氢生物碟呤的存在下,催化产生非特异性的杀菌物质NO,参与抗感染早期过程[11]。同时活化的巨噬细胞促进TNF-α、IL-1、IL-6等细胞因子大量释放,活化炎症细胞,增强机体对结核分枝杆菌的杀伤功能。本实验中巨噬细胞用结核分枝杆菌感染后TNF-α、IL-1、IL-6释放显著增加。

研究发现,多种miRNA在肺结核患者血液中异常表达[12]。如miR-21[13]、miR-146a[14]和miR-144[2]等。据报道miR-221可转录调节炎症相关因子的表达[4],可通过靶向调节脂联素受体1调节血管内皮细胞的炎性反应[5]。Ni等[6]发现miR-221在结核分枝杆菌感染的巨噬细胞中表达降低。本研究发现,结核分枝杆菌感染巨噬细胞后,miR-221表达显著降低,与现有文献报道[6]一致。此外,通过在巨噬细胞中转染miR-221模拟物及抑制物,提示miR-221模拟物降低炎性因子和NO分泌,miR-221抑制物促进炎性因子和NO分泌,提示巨噬细胞可能通过调节miR-221的表达,抑制结核分枝杆菌的免疫清除。

ROCK是炎症疾病中的关键调节分子,在脊髓损伤[15]、急性肺损伤[16]和心血管疾病[17-18]等多种炎症疾病中起重要作用。ROCK以ROCK1和ROCK2两种异构体形式存在。ROCK1对炎症细胞的黏附起重要的调节作用[19],且有实验证明ROCK1可激活巨噬细胞介导的炎性反应[20]。本研究用生物信息学的方法预测出miR-221与ROCK1存在良好的碱基互补关系,并通过双荧光素酶报告基因、qRT-PCR和Western blot提示miR-221可靶向调控ROCK1的表达。

综上所述,miR-221在结核分枝杆菌感染的巨噬细胞中表达降低,miR-221负性调节结核分枝杆菌诱发的巨噬细胞免疫应答,并可靶向抑制ROCK1 mRNA和蛋白的表达,为研究巨噬细胞在机体内的免疫机制提供理论依据。

[参考文献]

[1] Mjid M,Cherif J,Ben Salah N,et al. Epidemiology of tuberculosis [J]. Rev Pneumol Clin,2015,71(2/3):67-72.

[2] Liu HY. Down-regulation of miR-144 after Mycobacterium tuberculosis infection promotes inflammatory factor secretion from macrophages through the Tpl2/ERK pathway [J]. Cell Mol Biol(Noisy-le-grand),2016,62(2):87-93.

[3] 程涛,伍伟玲,黄河.肺结核患者Th1/Th2/Treg/Th17免疫应答的临床研究[J].中国医药导报,2017,14(26):109-112.

[4] Marques-Rocha JL,Samblas M,Milagro FI,et al. Noncoding RNAs,cytokines,and inflammation-related diseases [J]. FASEB J,2015,29(9):3595-3611.

[5] Chen CF,Huang J,Li H,et al. MicroRNA-221 regulates endothelial nitric oxide production and inflammatory response by targeting adiponectin receptor 1 [J]. Gene,2015, 565(2):246-251.

[6] Ni B,Rajaram MV,Lafuse WP,et al. Mycobacterium tuberculosis decreases human macrophage IFN-gamma responsiveness through miR-132 and miR-26a [J]. J Immunol,2014,193(9):4537-4547.

[7] Barry SE,Chan B,Ellis M,et al. Identification of miR-93 as a suitable miR for normalizing miRNA in plasma of tuberculosis patients [J]. J Cell Mol Med,2015,19(7):1606-1613.

[8] Lundqvist-Gustafsson H,Norrman S,Nilsson J,et al. Involvement of p38-mitogen-activated protein kinase in Staphylococcus aureus-induced neutrophil apoptosis [J]. J Leukoc Biol,2001,70(4):642-648.

[9] Schlesinger LS. Macrophage phagocytosis of virulent but not attenuated strains of Mycobacterium tuberculosis is mediated by mannose receptors in addition to complement receptors [J]. J Immunol,1993,150(7):2920-2930.

[10] Torres-Juarez F,Cardenas-Vargas A,Montoya-Rosales A,et al. LL-37 immunomodulatory activity during Mycobacterium tuberculosis infection in macrophages [J]. Infect Immun,2015,83(12):4495-4503.

[11] Huang S,Robinson JB,Deguzman A,et al. Blockade of nuclear factor-kappaB signaling inhibits angiogenesis and tumorigenicity of human ovarian cancer cells by suppressing expression of vascular endothelial growth factor and interleukin 8 [J]. Cancer Res,2000,60(19):5334-5339.

[12] Xu Z,Zhou A,Ni J,et al. Differential expression of miRNAs and their relation to active tuberculosis [J]. Tuberculosis,2015,95(4):395-403.

猜你喜欢
物组报告基因荧光素酶
miR-365靶向调控USP22促进大肠癌细胞组蛋白修饰和EMT
miR-122对脑缺血再灌注损伤小鼠脑梗死体积及胰岛素样生长因子-1受体通路的影响
NNMT基因启动子双荧光素酶报告系统的构建及其与SND1靶向关系的验证
不同双荧光素酶方法对检测胃癌相关miRNAs靶向基因TIAM1的影响
miRNA-19a在结肠癌中的表达及对结肠癌细胞增殖活性的影响分析
重组双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2-Intron构建转染及转染细胞萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶表达
miRNA-30a-5p过表达对肾癌细胞株786-0增殖、凋亡的影响
基于报告基因检测的PXR、FXR和LXRα激动剂高通量筛选模型的建立
启动子陷阱技术在植物启动子克隆研究中的应用
报告基因标记在干细胞治疗急性心肌梗死中的应用进展