结直肠癌中葡萄糖转运蛋白-12作为化疗联合用药靶点的研究

高 雷 张 帆 孙 丽 李 娜 崔海港

葡萄糖转运蛋白-12(glucose transporter-12,GLUT12)是葡萄糖转运体GLUT家族的一员[1],主要分布于脂肪和骨骼肌细胞内，负责葡萄糖的转运[2]。肿瘤组织新陈代谢率高，对营养物质的需求高。与正常细胞相比，癌细胞对葡萄糖有着更高的需求[3]。癌细胞通过葡萄糖转运蛋白转运葡萄糖以满足细胞营养需求，研究结果似乎能解释GLUT12蛋白特异性地表达于乳腺癌、前列腺癌以及神经胶质瘤细胞中的现象[4-5]。

目前仅有关于GLUT12在结直肠癌(colorectal cancer,CRC)细胞株HT29中报道[5]，其在CRC组织中的表达和功能尚不清楚。槲皮素(quercetin,QC)是广泛存在于植物中的一种黄酮类化学成分，对多种恶性肿瘤如胃癌、乳腺癌、肝癌、宫颈癌、结肠癌、卵巢癌、胆囊癌等均有抑制作用[6]。QC能抑制小肠上皮葡萄糖共转蛋白SGLT1[7]，对GLUT12等葡萄糖转运蛋白的作用却不清楚。为探讨能否将GLUT12作为治疗CRC的靶点，本文研究了 GLUT12在CRC细胞和组织中的表达情况, 在此基础上考察了联合使用QC和奥沙利铂(oxaliplatin,OXA)对CRC细胞的杀伤作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 人结肠癌DLD-1、HCT-15以及SW620细胞均购自于南京凯基生物有限公司。HIEC-6正常人肠上皮细胞购自于上海江林生物科技有限公司。

1.1.2 药物与试剂 OXA(美国Sigma-Aldrich公司，09512)；QC(上海纯优生物科技有限公司, 117-39-5)；MTT及二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(美国Sigma-Aldrich公司，D2650)；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司，11012-8611)。DMEM高糖配方培养基(美国Sigma-Aldrich公司, D5546)；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)蛋白定量试剂盒(江苏碧云生物技术研究公司, P0010)。0.5%醋酸结晶紫溶液(实验室自配)；抗体GLUT12及β-actin(美国Abcam公司, 批号分别为ab75441和ab8226)；其他抗体(二抗)购自于Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA, USA, 批号分别为sc-516132，sc-516192)。EZ-10 DNAaway (上海生工公司, B618133)。

1.1.3 实验仪器 CO2培养箱(美国Bio-Rad公司)；NUAIRE生物安全柜(美国Nuaire公司)；倒置显微镜(日本Olympus公司)；NIKON Eclipse荧光显微镜(日本NIKON公司)；Spectra Max M2 多功能酶标仪(美国Molecular Devices公司)；Chemi doc XRS凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)；Mini-PROTEAN Tetra转印系统(美国Bio-Rad公司)；T100型pcr基因扩增仪(美国Bio-Rad公司)；低温冰箱(美国Thermo Scientific)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将人结肠癌DLD-1、HCT-15和SW620以及正常人肠上皮HIEC-6细胞接种于T25培养瓶中，种植密度为每瓶约1×106细胞。细胞培养于含DMEM的高糖培养基中(含10% 胎牛血清，青霉素-链霉素1×105U/L，2.0 g NaHCO3)培养基，置于37℃、5%CO2的培养箱里进行培养，每隔3～5 d换培养液，并仔细观察细胞的生长状况。当细胞生长密度达到80%～90%时，用胰蛋白酶消化并传代。

1.2.2 肿瘤组织的采集、存放及处理 采集20例CRC患者的肿瘤组织，试验经由伦理委员会批准，所有患者实验前均签订知情同意书。患者年龄50～70岁，未经过放化疗，未有长期服用其他药物的历史，肝肾功能等指标也处于正常范围。采集的肿瘤组织全部经过病理技师确认。采集的肿瘤或者周围的正常组织大小为2～3 cm，组织采集后立即用冰生理盐水冲洗，冷冻并存放于液氮中。免疫组化前，所有样本解冻并经专业的病理技师进行石蜡包埋处理。

1.2.3 逆转录-聚合酶链反应法检测 GLUT12基因表达 按1.2.1中所述条件传代培养人结肠癌DLD-1、HCT-15、SW620及正常人肠壁HIEC-6细胞。细胞生长密度达到80%～90%时，加入细胞裂解液裂解细胞，用EZ-10 DNAaway试剂盒提取细胞总RNA。用NANOdrop测量RNA含量及纯度。根据EZ-10 DNAaway试剂盒说明书，A260/A280>1.8被认为是合格样品。将总RNA用逆转录试剂盒合成模板单链cDNA。以cDNA为模板，对合成的cDNA进行PCR，PCR条件设定为：95 ℃ 1 min，95 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，75 ℃ 30 s，循环进行35次。所得PCR产物经海藻糖凝胶电泳分离，紫外条件下可视化处理并拍照记录产物条带，使用IMAGE J 软件 (美国)分析条带的强弱，以各种癌细胞株中GLUT12表达强度值和正常HIEC-6细胞中GLUT12表达强度值的比值表示GLUT12 PCR产物在该细胞中的表达强弱。

1.2.4 免疫组化法检测肿瘤组织中GLUT12蛋白表达 将含有肠癌组织的石蜡切片在二甲苯和不同浓度的乙醇水溶液中进行脱蜡和脱水处理。然后，将切片置于含有3%的H2O2的溶液中，室温孵育30 min后，在高压锅中进行抗原修复。磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution，PBS)水洗3次，每次10 min。GLUT12一抗(Abcam: ab75441)4 ℃ 过夜孵育，PBS水洗3次，每次10 min。添加辣根氧化酶标记的二抗(Santa Cruz: sc516132)室温孵育2 h后，PBS水洗5次，每次5 min。滴加二氨基联苯于组织切片上，显色反应须控制在1 min之内完成。然后水洗玻片10 min，苏木精复染5 min，乙醇梯度脱水，透化，封片，光学显微镜下镜检。采用盲法对染色的切片进行打分[8]，0分为染色阴性，1分为染色较弱，2分为中等强度表达，3分为较强表达，4分为最强表达。

1.2.5 免疫荧光法检测细胞GLUT12蛋白表达 将人结肠癌DLD-1细胞种植于含有圆形盖玻片的24孔细胞培养板中。2～3 d后，细胞密度达到60%～80%时，用不含葡萄糖的DMEM培养基孵育4 h，分别加入5、10 mM葡萄糖作为处理组，加入10 mM葡萄糖+5 mM QC作为共同培养组，对照组只加培养基。共同孵育6 h后，吸掉旧培养基，加入冰冷的PBS溶液终止反应。每孔细胞用冷的4%的多聚甲醛固定15 min后，用含有0.2%的Triton X-100透化。透化后，每孔细胞加入Image-iTTMFX荧光信号增强剂(美国Life Tech)。用含有3%羊血清及2%牛血白蛋白的封闭剂封闭1 h，细胞与GLUT12一抗(Abcam: ab75441)孵育1 h，再与红色荧光素标记的二抗(Santa Cruz: sc-516192 )孵育2 h。清洗残余抗体后，将细胞转移到载玻片上，用含有荧光保护剂和细胞核染色剂Vectashield封闭。倒置荧光显微镜下，检查细胞荧光强度并拍照。ECL显影后，用GELDOC2000凝胶成像系统采集图片。

1.2.6 蛋白印记法检测GLUT12蛋白含量变化 用含有不同浓度葡萄糖(5、20、100 Mm)或抑制剂(10 mM)的培养基孵育人结肠癌DLD-1细胞6 h后，选用提取蛋白试剂盒提取细胞总蛋白，再用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)定量试剂盒进行定量。选用适合浓度的分离胶和浓缩胶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后选用硝酸纤维膜转移蛋白，再用5%的脱脂奶粉室温封闭4 h，含有吐温20的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution with tween-20, PBST) 洗3次，每次10 min，GLUT12一抗(Abcam: ab75441)在4 ℃冰箱孵育过夜，PBST洗3次，每次10 min，再加辣根过氧化物酶标记的二抗(Santa Cruz: sc516132)稀释液室温孵育2 h，PBST洗3次，每次10 min。可视化处理并拍照记录凝胶中产物条带, 使用IMAGE J 软件 (美国)分析条带的强弱，以各种癌细胞株中GLUT12表达强度值和正常HIEC-6细胞中GLUT12表达强度值的比值表示GLUT12在该细胞中的表达强弱。

1.2.7 MTT比色法检测细胞活力 胰酶消化生长旺盛的DLD-1和SW620结肠癌细胞，稀释成5×107/L的细胞悬液。用排枪接种于96孔培养板中，每孔含100 μL细胞悬液，每个药物处理组设置4个重复孔。细胞过夜贴壁后，用排枪吸弃旧的细胞培养液，根据向培养孔中添加含有不同浓度OXA或者GLUT12抑制剂的培养液200 μL。实验分别分为空白组，槲皮素组 (Q, 浓度为 5 mM)， OXL组 (OXA，浓度为10 μM),和OXL与槲皮素联合组 (OXL+Q：OXA浓度为10 μM, 槲皮素浓度为 5 mM)，空白组只添加相同体积的培养液。CO2培养箱中持续孵育72 h后，每孔加入20 μL浓度为5 mg/mL的MTT溶液，继续孵育2 h后，用排枪轻轻地吸取培养液，加入200 μL DMSO用以溶解紫色结晶，持续震荡15 min后，使用酶标仪在490 nm条件下测量各孔的吸光度。对照组加入不含药物的等体积细胞培养液。实验重复3次后，按下列公式计算细胞存活率：细胞存活率(%)=(药物处理组吸光度/对照组吸光度)× 100%。

1.2.8 肿瘤细胞集落生成实验(colony forming assay,CFA) 将结肠癌DLD-1细胞种植于6孔培养板中，每孔600细胞。24 h后，每孔细胞加入含有各种浓度药物的培养基，实验分别分为空白组、槲皮素组(Q,浓度为 5 mM)、OXL组 (OXA，浓度为5μM)和OXL与槲皮素联合组 (OXL+Q：OXA浓度为5 μM, 槲皮素浓度为5 mM)，空白组只添加相同体积的培养液。连续培养14 d。期间单个细胞会分化成由多个细胞所组成的细胞集落。培养结束每孔细胞用2 mL温热的PBS轻柔润洗后，加入2 mL 0.5%结晶紫溶液，轻柔震荡5 min，用PBS轻轻漂洗3次后，细胞集落会被染成蓝色的颗粒状可见物。人工清点细胞组成>50的细胞集落数目。使用Image J软件中的粒子直径分析功能计算各个培养孔中的细胞群落的平均直径(软件默认为任意单位)。

2 结果

2.1 GLUT12基因在CRC中的表达 GLUT12基因在3种癌细胞株中均有表达，在DLD-1细胞株中的表达含量最高，为(3.5±0.7)，在SW620、HCT-15细胞株中的相对含量分别为(3.1±0.2)和(2.6±0.4)。另外，与DLD-1、 SW620和HCT-15癌细胞相比，正常肠上皮细胞HIEC-6中的GLUT12含量最低(相对表达值为1，P< 0.05)。 见图1。

A

B

A B

注：A为核酸在凝胶中的条带图；B为GLUT12基因相对于HIEC-6表达值，与HIEC-6比较，*P<0.05

2.2 GLUT12蛋白在CRC中的表达 GLUT12在肿瘤组织和正常组织中均有不同程度的表达，GLUT12在肿瘤组织中的表达水平为(3.2±0.3)，正常组织的表达水平为(0.5±0.6),差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图2 GLUT12在肿瘤及正常组织中的表达(免疫组化法，×400)

2.3 GLUT12蛋白在CRC细胞中的表达定位与水平的变化 在含有少量葡萄糖的培养基中GLUT12在细胞中仅有少量的表达，主要集中于细胞核周围。随着培养基中葡萄糖含量的升高，GLUT12含量升高，主要集中分布于细胞膜周围。当DLD-1细胞与GLUT12抑制剂一起培养时，高糖条件并不能提高该蛋白在细胞中的表达，也不能改变其在细胞中的定位。见图3。

免疫印迹法也发现，细胞在含低浓度葡萄糖的培养基培养时 (5 mM)，GLUT12的表达含量很低(97.3±6.8)%。升高培养基中的葡萄糖含量(20,100 mM)，该蛋白表达亦显著性地升高，分别为(123.2±5.7)% 与(193.4±5.2)%，差异有统计学意义(P<0.05)。当细胞和GUT12抑制剂QC一起孵育时，即使升高培养液中的葡萄糖含量，GLUT12的表达水平也未出现显著变化。见图4。

2.3 GLUT12抑制剂对OXA杀伤肿瘤细胞的协同作用 MTT试验显示， DLD-1 细胞和QC一起孵育后，其活力和空白处理组相比并没有显著变化[Q:(94.7±4.3) %vs空白：(95.8±5.4)%]，差异无统计学意义(P>0.05)。OXA和细胞一起孵育能显著地降低细胞活力[OXL:(89.4±4.2)%vs空白：(95.7±5.2)%，P< 0.05]。当OXA处理的DLD-1细胞培养液中联合加入QC时，细胞的活力降至更低的水平[OXL+ Q:(63.3±7.1)%vsOXL:(89.7±4.2)%,P<0.05]。然而，对于SW620细胞来说，QC并不能产生类似的药效协同作用。见图5。

接下来的CFA实验考察了癌细胞群落的数量和粒径。QC单用并不会对癌细胞群落的数量产生明显的影响[QC:(362.3±23.7)vs空白：(353.2±13.4),P>0.05]。OXA和细胞孵育并没有明显地减少细胞群落的数量[OXL:(347.6±17.2)vs空白：(352.7±13.4),P>0.05]。从形成的癌细胞群落的粒径来说，QC单用亦不会对癌细胞群落的粒径产生明显地影响[QC:(716.8±15.2)vs空白：(591.7±33.4),P>0.05]。OXA和细胞孵育却能明显地减少细胞群落的粒径 [OXL:(125.1±12.4)vs空白：(591.7±32.6),P< 0.05]。当QC和OXA联用几乎能杀死所有癌细胞群落。见图6。

图3 荧光显微镜下GLUT12蛋白在不同条件下的变化(×400)

注：A表示对照组；B表示5 mM葡萄糖处理组；C表示10 mM葡萄糖处理组；D表示10 mM葡萄糖+5 mM QC共同培养组

图4 蛋白印迹法检测不同条件下GLUT12的变化

注：A为GLUT12蛋白条带图；B为相应条带的密度测定柱状图，与低糖组(5 mM)相比，*P<0.05

图5 MTT法检测QC与OXA的协同作用

注：Q为QC组(浓度为5 mM)；OXL+Q为QC与OXA联用组与空白组相比，*P<0.05

图6 肿瘤集落生成法检测QC与OXA的协同作用(n=3)

注：A为不同药物孵育条件下肿瘤细胞的集落生成情况，使用0.5%结晶紫溶液对细胞群落进行染色；B为相应的关于肿瘤集落大小比较，Q为QC组(浓度为5 mM)，OXL+Q为QC与OXA联用组

3 讨论

本研究证实GLUT12在CRC细胞和肿瘤组织中均有表达。体外功能验证试验也提示该蛋白在CRC的发展中起到一定的促进作用。细胞毒性实验说明该蛋白有可能成为联合用药方面的治疗性靶点。

RT-PCR实验证实GLUT12基因在CRC细胞中异常升高，免疫组化的结果证实其蛋白在肿瘤组织中的表达和正常组织比也是升高。目前关于GLUT12在CRC中的报道较少，Pujolgimenez等[5]发现GLUT12基因在CRC细胞HT29中的表达是上调的。本研究选用更多类型的CRC细胞株作为研究对象。为了对比该研究也观察了该基因在正常结肠上皮细胞HIEC-6中的表达水平，综合Pujolgimenez等的实验以及本实验的结果，可以推测CRC肿瘤细胞需要较多的葡萄糖转运体来维持对葡萄糖的营养需求[9-10]。Pujolgimenez等[5]发现GLUT12在乳腺癌与前列腺癌中的表达是异常升高，与本实验的发现一致。

细胞免疫化学和免疫印迹实验显示，GLUT12蛋白在高糖环境下会上调表达浓度，表明GLUT12在体内肿瘤组织中有可能是通过提高自身表达水平来满足营养需求。在静息状态下，GLUT12主要分布于细胞核周围，当细胞培养基中加入胰岛素时，GLUT12会转运到细胞膜周围，为转运葡萄糖做好准备[11]。本实验也发现了类似的现象，QC能阻断高糖引起的该蛋白表达的上调和细胞内的转运。本研究的发现与关于QC抑制葡萄糖转运蛋白的报道一致[12]。

MTT及CFA细胞毒性试验发现，QC与OXA合用会起到很好的协同作用，而在另一种CRC细胞株SW620上没有观察到类似的协同作用。鉴于DLD-1中的GLUT12含量比SW620高很多(见上述基因表达结果)，检测QC和OXA协同作用取决于GLUT12的基础表达含量的高低。另外，这种结果的差异也可能是由于这两种细胞来源的不同造成，如DLD-1细胞来源于人结肠腺癌细胞，而SW620细胞则是来源于人结肠癌转移灶[13]。

CRC细胞中有多种葡萄糖转运体存在[9]，如GLUT1和GLUT4等，本研究虽然证实CRC细胞或组织中的GLUT12确有表达，却未进一步考察这些葡萄糖转运体相互协作的具体作用机制。此外本次研究也未深入分析GLUT12是否还参于到糖酵解等代谢通路或者P53等信号通路，如条件允许还可围绕GLUT12开展更多机制性的研究。本文对GLUT12在CRC中表达和功能做了初步研究，在体外评价了GLUT12抑制剂QC和常用抗癌药物OXA联合应用的价值。这些发现为进一步验证GLUT12作为CRC治疗性靶点的可能提供了研究基础。