安徽省某三甲医院铜绿假单胞菌分布及耐药特点研究

殷 俊 常 啸 程 君 周仲松 苏 菲 叶 英 李家斌

铜绿假单胞菌(P.Aeruginos,PA)是一类革兰染色阴性的非发酵菌，在临床分离的病原菌中较常见，并且有逐渐上升的趋势。有报道[1]显示，因PA感染所致的病死率高达51%。由于PA特殊的耐药特点(细胞膜通透障碍)，以及对替加环素先天耐药的特征，临床治疗相对困难，耐药菌株较多，故而对PA进行耐药监测，统计其流行病学特征及研究其地区耐药基因的分布具有重要的意义。本研究收集安徽省某三甲医院2015年8月至2017年9月临床分离的PA野生株，进行了药敏分析，并对其进行了一定的分子生物学实验，以观测PA的耐药特点。

1 材料与方法

1.1 标本来源 收集安徽省某三甲医院2015年8月至2017年9月临床分离的1 857株PA野生株，均来源于临床确诊感染患者，并筛除重复菌株，鉴定按常规操作规程鉴定到位。

1.2 方法 采用自动化药敏板进行药物敏感实验鉴定，获得临床分离株后，按照说明书要求调整菌悬液浓度，药敏板在机外孵育，一次性上机读取结果，由计算机进行分析处理，并报告药敏结果。质控菌株为AATCC27853。应用自动化药敏板对1 857株PA进行了药敏检验，包括阿米卡星、环丙沙星、左氧氟沙星、哌拉西林他唑巴坦、头孢他啶、头孢吡肟、妥布霉素、庆大霉素及亚胺培南共9种抗菌药物。药敏实验结果按CLSI 2016年标准进行判读[2]，分为敏感、中介、耐药3种结果，并用WHONET 5.3软件进行数据分析。PCR法对耐碳青霉烯类抗菌药物菌株进行耐药基因的扩增，包括blaTEM、blaPER、blaVEB、blaOXA、金属酶基因VIM、IMP、SIM、GIM及外膜蛋白OprD2基因。测序结果在GenBank上进行比对。

1.3 观察指标 将所有菌株编号后,判读其对不同抗菌药物的最低抑菌浓度值,根据CLSI 2016标准进行耐药、中介和敏感3种不同耐药程度的划分。耐药基因的扩增结果测序后与GenBank进行比对，相似性>95%判定为同一基因。

2 结果

2.1 菌株的时间分布特点 1 857株PA株中，发现分离株最少的月份为2015年9月(43株)、2016年4月(43株)、2016年5月(42株)，最多的月份为2017年8月(118株)，2017年9月(113株)，2017年6月(98株)，多数月份分离菌株数在60～80株。见图1。

图1 2015年8月至2017年9月临床分离PA时间分布

2.2 菌株的临床科室分布特点 ICU和呼吸内科为PA分离最多的科室，其中该医院3个不同ICU共分离489株(26.33%)，其中ICU 221株(11.90%)，神经内科ICU 164株(8.83%)，急诊ICU 104株(5.60%)，呼吸科252株(13.57%)，其次为烧伤科127株(6.84%)。最后为神经内科116株(6.25%)，神经外科101株(5.44%)，泌尿外科92株(4.95%)，心外科67株(3.61%)，血液内科60株(3.23%)，内分泌科56株(3.02%)，康复科54株(2.91%)。

2.3 菌株来源分布 所有分离的菌株中，来源于痰液1 261株(67.91%)，尿液122株(6.57%)，分泌物115株(6.19%)，血液83株(4.47%)，手术切口74株(3.98%)，伤口分泌物54株(2.91%)，引流液31株(1.67%)，胆汁29株(1.6%)，支气管肺泡灌洗液18株(0.97%)，胸腔积液11株(0.59%)，脓液10株(0.54%)，中心静脉导管8株(0.43%)，气管分泌物7株(0.38%)，腹水6株(0.3%)，外周导管5株(0.27%)，咽拭子5株(0.27%)，结缔组织4株(0.22%)，胃液2株(0.11%)，关节液2株(0.11%)，上呼吸道2株(0.11%)，子宫分泌物2株(0.11%)，骨髓1株(0.05%)，脑脊液1株(0.05%)，透析液1株(0.05%)，其他3株(0.16%)。

2.4 PA的耐药结果 PA碳青霉烯类抗菌药物亚胺培南的耐药率达到32.69%，高于其他抗菌药物耐药率。对妥布霉素、庆大霉素及左氧氟沙星的耐药率较低，均小于18%。对阿米卡星的敏感率最高，达到78.08%。见表1。

表1 1 857株PA对不同抗菌药物的耐药结果[株(%)]

2.5 对碳青霉素类抗菌药物耐药的607株细菌耐药基因扩增结果 检出携带blaTEM34株，blaPER41株、blaVEB7株、blaOXA63株。检出携带VIM基因121株，IMP基因125株，SPM基因65株，SIM基因0株，GIM基因0株。其中有98株携带两种耐药基因，无携带3种及以上产酶耐药基因的菌株。测出孔蛋白基因缺失417株，占总数的68.7%。见图2。

图2金属酶及外膜蛋白电泳图

注：M为Marker；1为外膜蛋白丢失；2为SPM阳性；3为VIM阳性；4为IMP阳性

3 讨论

PA是广泛存在于社区及医院的一类致病菌，以院内感染多见，且难以从医院环境内清除，对如肿瘤、血液、ICU等病房的免疫力低下患者带来巨大潜在威胁。碳青霉烯类药物曾为治疗PA感染的重要药物，但随着临床的广泛应用，PA对该类药物的耐药率也逐步上升，因此在临床治疗中存在极大的困难[3]。对院内PA临床分离株进行研究，总结其空间、时间、标本来源分布太特征，监测其耐药特点，并对耐药机制进行分析，有助于对该院感染PA的患者及时采取相应措施，从而在第一时间选择有效药物。

该医院26个月共分离出无重复菌株的1 857株PA，且随时间推移，在数量上有逐步上升趋势，2017年8、9月临床分离的菌株数高于其他月份，与国内其他地区统计结论大致相仿[4]。提示今后PA可能会成为极常见的临床分离株。PA作为条件致病菌，具有非常强的适应能力，是医院感染中医院获得性肺炎以及呼吸机相关肺炎的主要病原菌[5-6]。在本研究中，绝大部分菌株来自住院患者。来自呼吸科的PA占13.6%，而痰标本占比则达到67.91%，这可能与住院患者机体免疫力下降，呼吸道屏障相对脆弱，呼吸道分泌物增加等因素有关。且有研究[7]指出，老年PA感染患者中，肺部感染发生率最高，与本研究统计结果一致。除痰液之外，尿液、各处分泌物及血液也是多见的标本来源。本研究中，ICU为分离出PA最多的科室，考虑与收住患者一般状态相关，与其他研究结果大致相符[7-9]。

在本研究中，PA对于哌拉西林/他唑巴坦和亚胺培南的敏感率较低，都低于60%，故而在该医院PA感染的治疗中，不推荐以上2种抗菌药物做为治疗PA的首选药物。阿米卡星对其敏感率较高，有78.08%的PA患者均对阿米卡星敏感，考虑到PA耐药的复杂性，结合PA对于头孢吡肟耐药性较低(16.05%)，可以考虑头孢吡肟联合阿米卡星做为该地区治疗PA的首选治疗。碳青霉烯类药物为抗革兰阴性菌感染的常用药物，但本研究中提示，PA对亚胺培南的敏感性低于60%，耐药率却高达32.69%，值得进一步完善相关检测，在本地区其他医院相关研究中，数据与本研究类似[10]。故在此基础上，甄选出全部607株对亚胺培南耐药的PA，进行了耐药基因及外膜蛋白OprD2基因的检测。

本研究中共检出携带VIM基因121株，IMP基因125株，此两种检出率最高，共占耐亚胺培南的PA中40.53%，SPM基因65株，占10.71%，SIM基因0株，GIM基因0株。blaTEM34株、blaPER41株、blaVEB7株、blaOXA63株。其中有98株携带2种耐药基因，无携带3种及以上产酶耐药基因的菌株。测出孔蛋白基因缺失417株，占总数的68.70%。此数据亦表明PA的耐药机制多样且复杂，而其对亚胺培南的耐药机制更存在多种因素的参与，其中外膜蛋白OprD2缺失率接近70%，充分说明了外膜蛋白缺失为PA对亚胺培南耐药的主要机制。但根据目前国内其他地区报道[11]，该数据存在地区及人群差异。

PA目前为医院感染的重要致病菌，预计近期临床PA感染会进一步增多。PA感染部位以呼吸道最为多见，泌尿系、伤口创面及血液或成为继呼吸道后的重要感染部位，故推测在该医院，泌尿系及血液的PA感染需加强警惕。外膜蛋白缺失目前仍为该医院耐亚胺培南的PA的主要耐药机制。根据药敏结果，可考虑头孢吡肟联合阿米卡星做为一线治疗方案。