双乌宣痹颗粒对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞凋亡及PI3K/Akt信号通路的影响

邹丽华，侯春福，陈志煌，华植，韦嵩

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种主要侵犯四肢关节，致使关节出现滑膜炎、滑膜增生、软骨和骨质损伤的慢性进行性自身免疫性疾病[1]。RA的确切病因尚不明确，近来研究表明，其炎症和破坏性特征主要由增生的滑膜引起，而滑膜的增生与滑膜成纤维细胞(fibroblast-like synoviocytes，FLS)增多有关[2-4]。研究显示，RAFLS过多主要因为其具有抗凋亡特性，RA滑膜中抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)和髓样细胞白血病因子(myeloid cell leukemia-1，Mcl-1)(Bcl-2家族成员)的表达增加[5]，引起FLS增殖与凋亡失衡，出现类似肿瘤样增长。亦有研究显示，RA-FLS的抗凋亡特性与信号通路磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinases，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)的激活有关[6]。研究表明，RA患者增生滑膜的血管组织表达p-Akt，且PI3K/Akt激活又可调节炎症介质的产生[7]，Bcl-2表达增加、PI3K/Akt通路激活与RA的发病密切相关。双乌宣痹颗粒是以祛除伏邪、宣发膜原为治则创立的治疗RA的经验方，前期研究表明其对RA有良好的治疗效果[8-9]，能抑制胶原关节炎大鼠滑膜的增生[10]，基因芯片筛选显示其治疗RA的机制与PI3K/Akt通路密切相关[11]。膜原与滑膜关系密切，RAFLS是RA滑膜中的主要细胞，而目前暂未见宣发膜原法与滑膜成纤维细胞的相关研究。本研究观察以宣发膜原为代表的双乌宣痹颗粒对RA-FLS的影响，探讨双乌宣痹颗粒治疗RA的可能机制。

1 材料与方法

1.1 滑膜组织的来源 选取2017年2－8月在原广州军区广州总医院确诊为RA并行膝关节清理术的患者。RA的诊断参照2010年美国风湿病学会(American College of Rheumatology，ACR)和欧洲抗风湿病联盟(European League Against Rheumatism，EULAR)联合提出的RA分类标准和评分系统[12]。纳入标准：①符合上述ACR/RULAR标准，年龄18～60岁，能耐受微创手术治疗的患者；②2周内未服用非甾体抗炎药、激素、免疫抑制剂、生物制剂；③自愿参与本研究并签署知情同意书。排除标准：①合并膝关节肿瘤、结核、感染、骨关节炎、痛风性关节炎等其他疾病；②合并心脑血管病、肝、肾、消化、造血系统、内分泌系统等严重原发性疾病；③因体质极度虚弱、精神因素、年龄过大等不能耐受手术；④关节局部有皮肤感染、肌肉坏死；⑤妊娠或哺乳期妇女。

1.2 主要仪器及试剂 流式细胞仪购自美国Millipore公司；多功能酶标仪购自美国Thermo Scientific公司。制川乌颗粒、制草乌颗粒、槟榔颗粒、鹿衔草颗粒、白芍颗粒、知母颗粒、青蒿颗粒购自广东一方制药有限公司；来氟米特(leflomit，LEF)购自福建汇天生物药业有限公司；高糖型细胞培养基(Dulbecco's modified eagle medium，DMEM)、北美胎牛血清购自美国Gibco公司；藻红蛋白(phycoerythrin，PE)标记抗人CD55抗体购自美国BioLegend公司；异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记抗人CD90(Thy1)抗体购自美国Ebioscience公司；胶原酶Ⅰ购自美国Sigma公司；抗Bax 抗体、抗Bcl-2抗体、抗磷酸化Akt抗体、抗Akt抗体、抗PI3K抗体购自英国Abcam公司。

1.3 实验分组及含药血清制备 40只SPF级雄性Wistar大鼠，体重180～220g，购自南方医科大学实验动物中心[许可证编号：SCXK(粤)2016-0041]，饲养于原广州军区广州总医院实验动物中心。大鼠随机分成5组，即高、中、低剂量双乌宣痹组[分别为17.28、8.64、4.32g/(kg.d)]、来氟米特[1.04mg/(kg.d)]组、生理盐水[8.64ml/(kg.d)]组。来氟米特溶于生理盐水中，配成1mg/ml溶液；双乌宣痹颗粒即川乌、草乌、青蒿、槟榔等颗粒按一定比例混合成复方颗粒，溶于生理盐水中，配成1g/ml溶液。根据药物溶液浓度和剂量折算系数表中人和大鼠系数比计算每只大鼠给药量，大鼠剂量(mg/kg)=系数(6.25)×人的剂量(mg/kg)。随后每天以各剂量的药物或生理盐水对大鼠进行灌胃，7d后腹主动脉采血，收集血清，56℃灭活后，-20℃保存备用。以各组含药血清替代胎牛血清用于细胞培养时，将细胞也分为相应的5组。

1.4 原代细胞的培养及鉴定 手术取下患者滑膜并立即放入含1%双抗的PBS中，剪碎至约1mm2大小后，于6孔板中加入1ml Ⅰ型胶原酶消化，并在倒置显微镜下观察，当见有分散的细胞团或单个细胞时，加入含10%胎牛血清的高糖培养基终止消化，经细胞筛过滤后，离心收集细胞，重悬于含20%胎牛血清的培养基进行培养、传代。取第4代细胞用抗Thy1、CD55抗体于流式细胞仪上鉴定。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡 取第4～7代处于对数生长期的RA-FLS以5×105cells/ml密度接种于6孔板中，每孔2ml；24h后换液，分别加入1.3中获得的5组动物含药血清(浓度为10%)配成的DMEM高糖培养基2ml；继续培养24h后，经膜联蛋白V(annexin V)-FITC/碘化丙啶(propidium iodide，PI)细胞凋亡检测试剂盒标记，采用流式细胞术检测细胞凋亡情况。

1.6 Western blotting检测细胞PI3K、Akt、p-Akt、Bax、Bcl-2蛋白表达 5组RA-FLS培养24h后，提取蛋白，常规进行Western blotting测定，并使用Image J软件分析蛋白光密度值。

1.7 统计学处理 采用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，并采用Levene's检验方差齐性，若方差齐则采用LSD-t检验进行比较，若方差不齐则采用Tamhane's分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 原代细胞培养及鉴定 原代细胞分离培养次日，可见少量梭形、多边形、树突状细胞，细胞核明显；第3～5天细胞生长速度加快，至8～10d细胞达90%融合，可传代；第2～3代细胞生长速度较快，4～5d可长满；第4代细胞形状均一，呈梭形，细胞核位于细胞中央，呈卵圆型(图1)。流式细胞仪检测第4代RA-FLS表面CD55、CD90(Thy1)抗原的表达，结果显示，CD55的阳性率为99.27%，CD90(Thy1)的阳性率为98.81%，CD55、CD90(Thy1)双阳性率为98.69%，表明该细胞为FLS，且纯度较高，可用于后续实验(图2)。

图1 原代滑膜成纤维细胞Fig.1 Primary fibroblast-like synoviocytes

图2 滑膜成纤维细胞的流式细胞术鉴定Fig.2 Identification of fibroblast-like synoviocytes (Flow cytometry)

2.2 RA-FLS凋亡率测定 与生理盐水组相比，高、中、低剂量双乌宣痹组与来氟米特组细胞凋亡率明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。与来氟米特组比较，高、中剂量双乌宣痹组细胞凋亡率明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05，表1，图3)。

2.3 RA-FLS细胞中PI3K、Akt、p-Akt、Bax、Bcl-2表达水平 与生理盐水组及来氟米特组比较，高、中剂量双乌宣痹组Bax的表达水平明显升高，Bcl-2表达水平明显降低，Bax/Bcl-2的比值明显升高，差异均有统计学意义(P＜0.05，图4，表2)。与生理盐水组比较，各药物组PI3K、p-Akt的表达水平明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)；与来氟米特组比较，高、中剂量双乌宣痹组p-Akt、PI3K蛋白表达水平下降，差异有统计学意义(P＜0.05)。各组Akt蛋白表达水平无明显差异(图4，表3)。

表1 各组滑膜成纤维细胞凋亡率比较(%，±s，n=4)Tab.1 Apoptotic rates of fibroblast-like synoviocytes in different groups (%，±s, n=4)

表1 各组滑膜成纤维细胞凋亡率比较(%，±s，n=4)Tab.1 Apoptotic rates of fibroblast-like synoviocytes in different groups (%，±s, n=4)

SWXB. Shuangwuxuanbi granule; (1)P＜0.05 compared with normal saline group; (2)P＜0.05 compared with leflunomide group

Group Early Late Total Normal saline 3.750±0.028 7.18±0.33 10.93±0.15 Leflunomide 19.830±0.043(1) 7.94±0.58 27.77±0.46(1)High-dose SWXB 24.520±0.044(1)(2) 10.19±0.61(1)(2) 34.71±0.89(1)(2)Middle-dose SWXB 18.350±0.034(1)(2) 12.52±0.62(1)(2) 30.87±0.51(1)(2)Low-dose SWXB 12.460±0.032(1)(2) 13.58±0.65(1)(2) 26.04±0.44(1)

图3 流式细胞术检测各组RA-FLS凋亡率Fig.3 Apoptotic rates of fibroblast-like synoviocytes (Flow cytometry)

3 讨 论

RA-FLS由于凋亡不足呈肿瘤样生长并产生炎症介质是RA的病理学特征[13]。研究发现，RA滑膜中具有抗凋亡特性的Bcl-2、p-Akt蛋白增多，PI3K/Akt途径在RA-FLS中被激活导致RA-FLS增殖[14]，且PI3K/Akt的激活能促进RA中炎症的产生[7]。Bcl-2蛋白家族在细胞凋亡中起关键作用，主要包括促凋亡蛋白(如Bax)和抗凋亡蛋白(如Bcl-2)，Bax/Bcl-2表达水平之间的平衡等，这对细胞存活和死亡至关重要，Bax/Bcl-2比值增加有助于体内凋亡途径的激活[15]。PI3K/Akt途径调节细胞的多种过程，包括细胞凋亡、迁移、侵入、细胞周期进展和存活[16]。当PI3K受到刺激时活化产生磷脂酰肌醇3,4,5三磷酸[phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate，PIP3]，从而激活Akt。Akt活化后可通过磷酸化多种转录因子抑制凋亡基因、增强抗凋亡基因的表达，从而促进细胞存活，如：①激活的Akt从细胞膜转移到细胞核，使叉头转录因子配基1 (forkhead transcription factor like 1，FKHRL1)磷酸化，影响凋亡基因死亡因子受体1(factor asscioated suicide，Fas-1)和Bcl-2相互作用介质(Bcl-2 interacting mediator of cell death，Bim)的转录[17]；②Akt通过磷酸化激活核转录因子κB抑制剂 (inhibitor of nuclear factor kappa-B，I-κB)的激酶(inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase，IKK)，导致I-κB磷酸化后与核转录因子κB (nuclear factor-kappa B，NF-κB)分离，分离后的NF-κB转位到细胞核内并诱导目的基因的表达，从而促进细胞的存活；③Akt通过磷酸化Bcl-2相关的死亡启动因子(Bcl-2 associated death promoter，Bad)，使Bad与胞质中的蛋白结合，而终止Bad在线粒体膜上对Bcl-2的拮抗作用，使释放后的Bcl-2恢复抗细胞凋亡的功能[18]。因此，调节Bax/Bcl-2及PI3K/AKt途径可能对RA的治疗有益。

表2 RA-FLS细胞中Bcl-2、Bax蛋白的表达(/β-actin，±s，n=4)Tab.2 Expression of Bcl-2 and Bax in rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes (/β-actin,±s, n=4)

表2 RA-FLS细胞中Bcl-2、Bax蛋白的表达(/β-actin，±s，n=4)Tab.2 Expression of Bcl-2 and Bax in rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes (/β-actin,±s, n=4)

SWXB. Shuangwuxuanbi granule; (1)P＜0.05 compared with normal saline group; (2)P＜0.05 compared with leflunomide group

Group Bax Bcl-2 Bax/Bcl-2 Normal saline 1.6±0.13 1.19±0.07 1.34±0.05 Leflunomide 1.64±0.11 0.84±0.05 2.01±0.21(1)High-dose SWXB 2.2±0.11(1)(2)0.60±0.04(1)(2)3.67±0.15(1)(2)Middle-dose SWXB 1.98±0.10(1)(2)0.59±0.03(1)(2)3.36±0.11(1)(2)Low-dose SWXB 1.43±0.08 0.98±0.05 1.46±0.15(2)

图4 RA-FLS凋亡及信号通路相关蛋白的表达(Western blotting)Fig.4 Expression of proteins related to apoptosis and signaling pathway of rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes(Western blotting)

表3 RA-FLS之PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达情况(/β-actin，±s，n=4)Tab.3 Expression levels of PI3K, Akt and p-Akt in rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes (/β-actin,±s, n=4)

表3 RA-FLS之PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达情况(/β-actin，±s，n=4)Tab.3 Expression levels of PI3K, Akt and p-Akt in rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes (/β-actin,±s, n=4)

SWXB. Shuangwuxuanbi granule; (1)P＜0.05 compared with normal saline group; (2)P＜0.05 compared with leflunomide group

Group PI3K Akt p-Akt Normal saline 1.18±0.15 1.00±0.13 0.91±0.035 Leflunomide 0.76±0.09(1)0.96±0.13 0.60±0.02(1)High-dose SWXB 0.43±0.06(1)(2)1.04±0.14 0.39±0.010(1)(2)Middle-dose SWXB 0.53±0.07(1)(2)0.90±0.12 0.43±0.015(1)(2)Low-dose SWXB 0.77±0.10(1)0.86±0.11 0.56±0.02(1)

双乌宣痹颗粒是韦嵩教授治疗RA的经验方，具有宣发膜原、祛邪除痹的功效。本课题组前期研究表明，该方能抑制RA模型大鼠滑膜的增生，减少淋巴细胞及单核细胞浸润，降低血清中白介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的表达[10]，并能抑制二甲苯引起的小鼠耳肿胀及醋酸引起的小鼠扭体，证明该方有良好的抗炎止痛作用[9]。通过基因芯片分析服药后RA患者滑膜中基因表达的差异，发现下调的基因主要集中在PI3K/Akt信号通路[11]。本研究选用临床常用的来氟米特作为对照，通过观察双乌宣痹颗粒含药血清在体外对RA-FLS凋亡及PI3K/Akt通路的影响，进一步探索了双乌宣痹颗粒治疗RA的机制。结果显示，高、中、低剂量双乌宣痹颗粒及来氟米特均能引起RA-FLS凋亡，且高、中剂量双乌宣痹组细胞凋亡百分率明显高于来氟米特组；高、中剂量双乌宣痹颗粒能明显上调Bax表达，抑制Bcl-2表达，使Bax/Bcl-2比值升高，效果优于来氟米特；高、中、低剂量双乌宣痹颗粒及来氟米特均能下调PI3K、p-Akt蛋白的表达，与来氟米特相比，高、中剂量双乌宣痹颗粒可使PI3K、p-Akt表达水平明显下调。上述结果提示，双乌宣痹颗粒治疗RA的机制之一可能是通过调节PI3K/Akt通路的活化及Bax/Bcl-2的表达而促进RA-FLS的凋亡。但本研究没有阐明双乌宣痹颗粒对Bax/Bcl-2的调节是否与PI3K/Akt通路有关。后续研究将通过阻断PI3K/AKt通路揭示双乌宣痹颗粒诱导RA-FLS凋亡发生的机制，并探究该方对RA-FLS炎症因子表达的影响。