葡萄糖预处理对大鼠心肌细胞糖毒性损伤的保护作用

闫毅凤，谭志鹏，刘海琼，王思懿，陈爱华

流行病学研究表明，心血管并发症是当前糖尿病患者的首要死亡原因[1-2]。糖尿病作为一种终身代谢性疾病，其长期慢性高血糖可损伤心肌细胞、心肌成纤维细胞和血管内皮细胞，进而导致动脉粥样硬化和高血压病[3]，还可诱发糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)。DCM将导致心肌组织的广泛病灶性坏死，增加心律失常、心力衰竭、心源性休克甚至猝死的发生风险。DCM的发病机制复杂，涉及心肌代谢障碍、氧化应激、钙调节异常、线粒体解偶联等多个方面[4]。葡萄糖清除率降低和肝葡萄糖扩增也可能是其发病原因之一[5]。但目前还没有任何具体机制或特效药物可解释或治疗DCM。

1986年，Murry等[6]发现反复短暂的心肌缺血再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)预处理能够减轻心肌缺血性损伤。因为缺血预适应能够激发应激机制，产生并释放心脏的内源性保护物质如腺苷、缓激肽、一氧化氮等，最终减轻更长时间的缺血缺氧性损伤，增强心肌对缺血缺氧的耐受力[7-8]。2015年，Wei等[9]提出了心肌肥厚预适应的概念，即心肌肥厚预处理能够抑制诱导心肌肥厚的calcineurin/NFAT信号通路，增强小鼠心脏的抗心肌肥厚能力，抑制心脏重构，延缓心衰进程并改善心功能。缺血预处理和肥厚预处理可在心肌缺血性损伤和肥厚性损伤中发挥保护作用。为此，本研究从心肌细胞活性、凋亡率、凋亡蛋白表达水平及线粒体膜电位等几个方面探讨葡萄糖预处理是否可减轻高糖对心肌细胞的糖毒性损伤。

1 材料与方法

1.1 原代心肌细胞 新生2～3d SD乳鼠由广东省动物实验中心提供，取乳鼠心脏用胰酶消化12h后，换用胶原酶消化心肌组织，提取细胞悬液。接种于100mm的培养皿中，在37℃含5% CO2的细胞培养箱中贴壁培养90min，成纤维细胞在90min内已大部分贴壁，去除贴壁的成纤维细胞，再继续用含BrdU(成纤维细胞抑制剂)的常规培养基培养48h，再用不添加BrdU的常规培养基培养96h，即可培养出高纯度的心肌细胞。原代心肌细胞总培养周期为6d。培养1d后显微镜下即可观察到聚集交织成片、搏动的心肌细胞。

1.2 主要试剂 D-葡萄糖粉、BrdU(美国Sigma公司)，DMEM培养基(美国HyClone公司)，MTS、TUNEL试剂(美国Promega公司)，JC-1试剂(中国碧云天公司)，抗体β-actin、Bcl-2、Bax、caspase-3、羊抗兔二抗(美国CST公司)。

1.3 细胞培养及分组 ①用不同高糖浓度(5、10、25、50、75、100mmol/L)和葡萄糖预处理浓度(5、10、20、30、40、50mmol/L)培养心肌细胞，分析心肌细胞活性，明确最佳浓度建立高糖模型(HG)组和预处理(PG)组，最终选择50mmol/L[10-11]和10mmol/L作为高糖处理和葡萄糖预处理浓度；②心肌细胞培养分组与时间线：对照组用常规培养基(DMEM，5mmol/L葡萄糖)培养6d；高糖(HG)组用常规培养基培养48h后，高糖(50mmol/L)培养96h；预处理(PG)组用高糖(50mmol/L)培养前，先用常规培养基培养24h，再用葡萄糖预处理(10mmol/L)4h，循环3次，每次间隔用含5mmol/L葡萄糖的DMEM处理4h。

1.4 MTS实验检测细胞活性 根据细胞生长状态，细胞培养约6d后进行MTS检测。细胞浓度约为1×105个/ml，按照1:10比例加入MTS细胞活性检测试剂，每孔总量100μl(即90μl常规培养基+10μl MTS检测液)，每组重复5孔，操作过程避光。在37℃避光孵育4h后以酶标仪读取490nm处的吸光度(OD)值，检测到的数值与活细胞数呈正比，正常对照组结果为0.8～1.2，保存并分析数据。

1.5 TUNEL染色法检测细胞凋亡率 细胞接种于放有盖玻片的6孔板中，建模后加入4%多聚甲醛中固定30min，PBS浸洗2次，每次5min；室温条件下用0.2% Triton X-100液孵透膜和避光条件下用工作液孵育1h；最后在共聚焦显微镜观察前24h内进行4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)核染10min，并用甘油与PBS比例为1:1的混合液防止猝灭进行封片，置于4℃冰箱避光条件下保存。在荧光显微镜下，活细胞细胞核因DAPI呈现亮蓝色荧光，凋亡细胞细胞核呈现绿色荧光，绿色荧光和蓝色荧光的比值即为细胞的凋亡率。

1.6 JC-1染色法检测线粒体膜电位 细胞接种于共聚焦皿中，每皿接种1ml细胞液，建模后加入JC-1染色工作液1ml，37℃孵育20min。孵育结束后，用JC-1 1×Buffer洗涤3次，每次5min，动作轻柔。然后用Hoechest 33342工作液室温避光孵育5min，孵育结束后用PBS洗3次，每次2min，最后弃去PBS，加入2ml常规培养基，于激光共聚焦显微镜下观察超微结构，红色与绿色荧光的比值代表线粒体膜电位的损伤程度。

1.7 Western blotting检测凋亡相关蛋白表达水平 电泳时恒压跑胶，浓缩胶80V，分离胶100～120V，电泳时间为1～2h，观察Marker蛋白条带较彻底分离或溴酚蓝将跑出胶外时，可终止电泳。转膜时用恒流200mA，转膜时间根据目的蛋白的分子量设定，一般分子量等于分钟数。转膜后室温封闭2h，敷一抗、二抗抗体，曝光。内参不封闭直接漂洗3次曝光。

1.8 统计学处理 采用SPSS 20.0软件进行统计分析。所有数据均以±s表示，均进行方差齐性检验，若方差齐，则多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验，若方差不齐时，组间比较采用Welch法进行近似方差分析，进一步两两比较采用Bonferroni或Dunnett's T3检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 葡萄糖预处理对高糖诱导的心肌细胞活性的影响 用不同的高糖浓度(5、10、25、50、75、100mmol/L)构建高糖模型培养心肌细胞，MTS实验检测结果显示，高糖浓度达到50mmol/L时，与对照组(5mmol/L葡萄糖)比较，心肌细胞活性明显降低(P＜0.05，图1A)。用不同的葡萄糖预处理浓度(5、10、20、30、40、50mmol/L)在建立高糖模型前对心肌细胞预处理3次，分析心肌细胞活性，结果表明，与HG组比较，不同浓度的葡萄糖预处理均可增强心肌细胞活性，其中预处理浓度为10mmol/L时统计学差异最明显(P＜0.05，图1B)，因此以10mmol/L作为本实验的最佳葡萄糖预处理浓度。

2.2 葡萄糖预处理对高糖诱导的心肌细胞线粒体损伤的影响 HG组红/绿荧光比值明显低于对照组，即HG组的线粒体膜电位ΔΨm较低，线粒体损伤较严重(P＜0.05)，PG组红/绿荧光比值高于HG组，即PG组的线粒体膜电位ΔΨm明显高于HG组(P＜0.05，图2)，而PG组与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.3 葡萄糖预处理对高糖诱导的心肌细胞凋亡的影响 TUNEL染色结果显示，与对照组相比，HG组的心肌细胞凋亡率明显增高(P＜0.01)，与HG组相比，PG组的心肌细胞凋亡率明显降低(P＜0.05，图3)，而PG组与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.4 凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3的表达量 Western blotting检测结果显示，在内参平齐的条件下，与对照组相比，HG组的Bcl-2蛋白表达明显降低，Bax和caspase-3蛋白的表达明显增加(P＜0.05)，而PG组的Bcl-2蛋白、Bax和caspase-3蛋白的表达与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05)；与HG组相比，PG组中Bcl-2蛋白的表达增多，Bax和caspase-3蛋白的表达有所减少(P＜0.05，图4)。

图1 葡萄糖预处理对心肌细胞活性及心肌细胞糖毒性损伤的影响(±s，n=5)Fig.1 Effects of glucose-pretreatment on the cardiomyocytes activity and the high glucose-induced toxicity on NRCs (±s, n=5)

图2 葡萄糖预处理对高糖诱导的心肌细胞线粒体膜电位ΔΨm的影响(n=3)Fig.2 Effect of glucose pretreatment on cardiomyocyte mitochondrial membrane potential ΔΨm (n=3)

图3 荧光显微镜下观察高糖预处理对心肌细胞凋亡的影响Fig.3 Fluorescence microscope images the effect of glucose pretreatment on cardiomyocyte apoptosis

图4 高糖预处理对心肌细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3表达水平的影响(Western blotting，n=3)Fig.4 Effect of glucose pretreatment on the expression of apoptosis-related proteins Bcl-2, Bax and caspase-3 (Western blotting, n=3)

3 讨 论

高糖环境对心肌细胞的损伤是多方面的，但其具体机制尚不明确[12]。在本研究中，HG组糖毒性严重损伤心肌细胞活性，但这种损伤与渗透压无关，因为50mmol/L高糖环境对细胞的损伤，远高于相同浓度甘露醇的渗透压作用对细胞活性的影响[10-11]。而10mmol/L葡萄糖预处理可增强心肌细胞活性，减轻心肌细胞糖毒性损伤。同时，葡萄糖预处理能够减少高糖诱导的心肌细胞凋亡。这与本课题组前期的研究结果一致，即高糖环境可增加心肌细胞凋亡[13]。本研究发现葡萄糖预处理通过影响凋亡相关蛋白，即上调Bcl-2的表达水平，下调Bax、caspase-3的表达水平来减少高糖所致的心肌细胞凋亡。细胞凋亡的发生主要由两个机制激活caspase通路[14]：外在通路激活caspase-8[15]或内在通路激活caspase-9，其中内在通路又称为线粒体依赖通路[16]，这两条通路均进一步激活凋亡的执行者caspase-3[17]。葡萄糖预处理能够增强线粒体膜电位，减轻线粒体损伤。大量研究表明，线粒体易受高糖条件的不良影响，导致结构功能受损，进而促进活性氧(ROS)的过量产生[18]。ROS又反向加重线粒体损伤，使线粒体膜通透性增加，膜电位下降，Ca2+聚集，离子稳态破坏，甚至激活相关调控基因触发凋亡的内在通路，损伤细胞核内DNA，最终导致心肌细胞凋亡[19]。本研究中，HG组caspase-3蛋白的表达量较对照组明显增高，线粒体膜电位也明显低于对照组；但PG组caspase-3蛋白的表达量明显低于HG组，线粒体膜电位也明显高于HG组，说明葡萄糖预处理对心肌细胞糖毒性损伤的保护机制涉及介导凋亡的内在通路，即线粒体依赖通路。相似的是，某些降糖类药物如利拉鲁肽等也可通过降低血糖来减轻线粒体损伤，进而减少凋亡，保护心肌细胞[20]。心肌缺血预处理能够减轻心肌缺血性损伤，心肌肥厚预处理能够增强心肌抗肥厚能力、减轻心肌肥厚性损伤[21-23]。笔者认为葡萄糖预处理可能类似于心肌缺血或肥厚预适应，对心肌细胞的保护作用与细胞的适应性和可塑性有密切关系[24-25]，本课题组也在继续深入探究其具体机制。在临床上，并不是所有疾病的控糖标准都是统一的，例如在保证不发生低血糖的条件下，脑卒中患者的血糖应控制在7.8mmol/L以下，但是对于有严重心血管风险的患者，血糖可考虑控制在10.2mmol/L以下[26]。因此，笔者认为长期高糖对心肌细胞是有损害作用的，但是短期适当浓度的葡萄糖预适应对心肌细胞的长期发展是有益处的。

本课题作为发现性研究存在着一定的创新性与局限性：根据缺血预适应、肥厚预适应的概念，我们提出葡萄糖预适应，同时证明了葡萄糖预适应能够减轻心肌细胞的高糖糖毒性损伤，对预适应概念的扩展具有一定的参考价值和启发意义。但在细胞水平研究葡萄糖预处理对心肌细胞高糖损伤的作用与体内环境存在一定的差异，本课题组也将继续更加深入地研究。

综上所述，本研究表明葡萄糖预处理在体外实验中能够增强心肌细胞活性、减少细胞凋亡、减轻线粒体损伤，从而减轻高糖对心肌细胞的糖毒性损伤。